丙型病毒性肝炎是一种严重危害人类健康的常见病和多发病。全球大约有L7亿的人口感染丙型肝炎病毒(HCV)。我国HCV感染者已达6000万。HCV急性感染后50—80％转变为慢性感染，其中的10-20％发展成肝硬化，并与肝细胞癌的发生密切相关。迄今Q一干扰素和病毒唑联合治疗是唯一的治疗方法，但这种治疗方法只对不到50％的患者显效，且具有费用高、易复发和副作用多等缺陷；尤其是我国流行的HCVib型，对α干扰素的治疗应答最低，因此，加强对HCV防治的研究至关重要。 HCV为单股正链RNA病毒，属黄病毒科，全长约9600个核苷酸，ORF区编码3010个氨基酸的多聚蛋白前体，经过宿主和病毒本身基因编码的蛋白酶裂解为十个功能性片段，包括4个结构蛋白(核心蛋白C、包膜蛋白E1、E2以及P7)及6个非结构蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)。HCVRNA5’端没有帽子结构，由5’非编码区(NCR)内的内部核糖体进入位点(IRES)介导启动并控制着整个HCV基因组的翻译过程，而HCVNS3蛋白具有丝氨酸蛋白酶和解旋酶活性，参与病毒蛋白翻译后加工，为病毒复制所必须。因此IRES及HCVNS3／4A丝氨酸蛋白酶是目前抗病毒治疗研究的主要靶位。 多年来针对HCVNS3／4A及HCVIRES抑制剂的研究取得可喜的进展，但由于缺乏理想的小动物模型，这些药物在体内抗HCV的作用效果，以及对其毒性、安全性等难以作出评估，极大地延缓了这些药物进入临床，因而建立适用于HCVIRES和NS3蛋白抑制剂筛选及评价小鼠模型迫在眉睫。 针对上述问题确立本课题的研究目的：基于成年小鼠，联合采用水动力转染技术与噬菌体整合酶系统，建立可用于评价HCVIRES和NS3／4A抑制剂的双靶位动物模型，作为经典转基因技术的补充或替代，用于评估针对HCVNS3／4A及HCVIRES抑制剂在体内抗HCV的作用效果，以及其毒性、安全性等。具体研究内容及结果如下： 1．建立了可促进外源基因在小鼠体内长期高水平表达的转基因技术平台。构建了可促进水动力转染外源基因在小鼠肝脏长期表达的特异性表达载体attB-pCI—AAA，该载体以真核表达载体pClneo为基础，用肝脏特异性调控序列的组合(包括白蛋白、载脂蛋白E及Q卜抗胰蛋白酶的调控序列)替代CMV，并在调控序列前加入了噬菌体整合酶识别位点attB，通过噬菌体整合酶的作用使得外源基因通过位点特异性重组整合到小鼠染色体上，从而使转入的基因在小鼠体内实现长期高水平稳定表达。该技术平台的建立为基因治疗及转基因动物模型的建立奠定了基础。 2．利用NS4A／4B是NS3／4A丝氨酸蛋白酶作用底物的特性，设计了融合基因EGFP—NS4A／4B—SEAP，将其插入上述真核表达载体attB—pCI—AAA建立了载体EGFP(A4AB)SEAP。理论上EGFP(A4AB)SEAP表达后产生的融合蛋白EGFP-NS4A／4B—SEAP定位于细胞内，在细胞内有NS3／4A丝氨酸蛋白酶共表达的情况下，在NS4A／4B处发生切割作用，就使得SEAP游离出来分泌到细胞外，通过测定胞外SEAP活性便可反映出HCVNS3／4A丝氨酸蛋白酶的活性，也反映了HCVIRES的功能。建立了稳定表达NS3／4A的COS一7细胞系及感染HCV的huh-7细胞系，用这两种细胞系对上述理论进行了验证，证实质粒EGFP(A4AB)SEAP具备指示丝氨酸蛋白酶活性的能力。 3．在以上实验基础上构建了双顺反子表达载体EGFP(△4AB)SEAP-NS3／4A，使NS3／4A和其切割底物片段NS4A／4B在同一载体中同时表达，融合基因EGFP—NS4A／4B-SEAP由“依赖帽子的扫描机制”翻译表达，而NS3／4A由HCVIRES介导翻译表达。首先在细胞水平验证了该表达体系，并以Balb／c小鼠为实验动物模型，通过水动力转染技术平台将该载体转染入小鼠体内，免疫组化检测到NS3蛋白在小鼠肝脏的表达，且持续2周在小鼠血清中检测到了高活性的SEAP，以上结果表明本实验成功建立了由HCVIRES介导的NS3／4A蛋白在小鼠体内的表达模型。 总之本研究将水动力转染技术及噬菌体整合酶联合应用于HCV转基因小鼠模型的建立，首次建立了可用于评价HCVIRES和NS3／4A活性的双靶位动物模型，本研究为今后进行抗HCV药物的评价奠定了基础。