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目的:观察大豆苷元(daidzein,DD)对大鼠心室肌细胞钠通道、瞬时外向钾通道、L型钙通道的电流及动力学特征的影响,探讨其对心肌细胞保护作用的机制。方法:MTT法检测DD的毒性;Langendorff主动脉逆行灌流和单酶解法分离大鼠单个心肌细胞;通过全细胞膜片钳技术,在电压钳模式下观察、记录、分析DD不同剂量组低(1μmol/L)、中(3μmol/L)、高(10μmol/L))给药前、后大鼠心肌细胞离子通道电流及其动力学特征的变化。结果:1.DD对乳鼠心肌细胞活力的影响:SD乳鼠心肌组织经0.25%的胰酶液4次消化,获得心肌细胞。后接种于培养皿中,隔24～48 h换液。待倒置显微镜下观察心肌细胞充斥视野80-90%时,在乳鼠心肌培养细胞液中加入不同浓度DD(0.1、0.3、1、3、10、30、100)μmol/L,再继续培养24 h后,随着药物浓度增加而降低,细胞的存活率也不断下降。其中,当所加入的DD终浓度为30～100 μmol/L时,心肌细胞活力的降低最明显,与给药前相比,差异具有显著性(p<0.05)。因此,我们选取DD终浓度为1、3、10μmol/L作为后续膜片钳实验时的用药剂量。2.急性分离的心肌细胞形态学观察:倒置显微镜下观察急性分离的单个心肌细胞。首次即时分离的大鼠心肌细胞多见长杆状,横纹清晰,细胞膜边缘完整,立体感强,表面无凹陷和气泡。大多处于静息状态(比例70%-90%),少部分已收缩为椭圆状或者团状。复钙后,40%～60%的细胞保持仍保持原有形态,其将被用于下面的药物干预实验。3.DD对大鼠心肌细胞钠通道的影响:(1)DD对INa的浓度依赖性:在协定的保持电位和钳制电位下,引导出INa。与对照组相比,低浓度DD(0.1μmol/L)对INa无影响。但随着DD浓度的增加(0.3-10μmol/L),药物则对INa呈现出抑制作用,其电流密度由给药前的(-53.9±6.35)pA/pF依次降为给药后的(-33.78±3.24)pA/pF、(-25.16±4.24)pA/pF、(-22.28±3.54)pA/pF 和(-17.96±4.56)pA/pF(P<0.05),表现出浓度依赖性抑制作用。(2)DD对INa的电流-电压(Ⅰ-Ⅴ)曲线的影响:与对照组相比,DD 1、3、10μmol/L使电流-电压(Ⅰ-V)曲线上移。但是,Ⅰ-Ⅴ曲线的轨迹趋势、通道电流的激活电位、电流峰值电位和反转电位未变化。(3)DD对INa的激活和失活动力学的影响:按照特定的刺激方案,引导出INa的激活和失活曲线,给予不同浓度的DD(1、3、10μmol/L)后,观察其对INa的激活和失活曲线的影响。结果显示:DD(1、3、10μmol/L)使激活曲线向去极化方向移动。给药前及三个浓度下激活曲线的半数激活电压 V1/2 依次为(-40.99±0.32)mV、(-38.81±0.19)mV、(-35.67±0.78)mV、(-31.94±0.43)mV(P>0.05),可见 DD 延迟了钠通道的激活的趋势。DD(1、3、10 μmol/L)使失活曲线向超极化方向移动。给药前及三个浓度下失活曲线的半数失活电压V1/2依次为(-74.42±0.44)mV、(-79.74±0.45)mV、(-82.81±0.59)mV和(-86.5±0.77)mV(P<0.05),即DD加快钠通道的失活。(4)DD对INa失活后恢复曲线:同等条件下,DD给药后使INa的失活后恢复曲线左移,τ为通道失活后恢复时间常数由给药前(21.35±0.13)ms依次变为(15.49±0.24)ms、(13.30±0.32)ms和(11.31±0.22)ms(P<0.05)。结果表明,DD以浓度依赖性加快INa从失活态向激活态转变的时间。4 DD对大鼠心肌细胞瞬时外向钾通道的影响:(1)DD对Ito的浓度依赖性:稳态激活程序激引发出外向电流,加入4-AP可显著阻断该电流,证实该电流为Ito。待电流趋于稳定后,用细胞外液冲洗后,Ito电流逐渐恢复到给药前水平,提示DD对Ito的作用是可逆的。DD(0.1 μmol/L)对Ito几乎不影响,而DD在0.3、1、3、10μmol/L浓度下对心室肌细胞Ito抑制作用越来越强。(2)DD对Ito的电流-电压(I-V)曲线:在DD(0-10μmol/L)下,给予连续变化的步阶,测通道电流的大小作出Ito电流-电压(Ⅰ-V)曲线。与对照组相比,It。的电流密度随浓度增加而减小。然而,Ⅰ-Ⅴ曲线形态以及反转电位保持不变。(3)DD对Ito的激活和失活动力学:空白对照条件下,归一化拟合激活电导曲线的V1/2为(13.07±0.58)mV,k 为(13.87±0.52)。1、3、10 μmol/L DD 分别为(15.76±0.40)mV/(13.43±0.35)、(17.59±0.67)mV/(13.83±0.59)、(19.65±0.48)mV/(13.34±0.43)(P>0.05)。稳态失活曲线的V1/2和 k 值(0、1、3、10μmol/L)分别为(-20.03±0.41)mV/(15.16±0.36)、(-22.27±0.35)mV/(15.50±0.31)、(-24.89 ± 0.42)mV/(15.28±0.38)、(-27.74±0.55)mV/(15.31±0.49)(P>0.05)o当DD作用后,稳态和激活曲线均几乎没有发生移动。因此,DD并未从Ito的激活和失活状态影响通道的开放和关闭难易。(4)DD对Ito失活后恢复曲线:给予细胞膜电压刺激,开放的通道会逐渐失活,再给予电压刺激通道将不再开放成失活态,最后给予一电压刺激,失活态逐渐恢复。引发DD作用前后的瞬时外向钾通道失活后恢复电流,并可拟合电流恢复曲线。DD使Ito失活后恢复曲线显著右移,τ随浓度增加而延长(P<0.05)。5.DD对大鼠心肌细胞L型钙通道的影响:(1)心肌细胞ICa-L的确定:经方波刺激诱发一串内向电流,该电流可分别被含有CdCl2(钙通道阻滞剂)、NiC12(特异型T型钙通道阻滞剂)、维拉帕米(特异性L型钙通道阻滞剂)的台式液灌流几乎阻断、几乎不被阻断、几乎阻断,证明所记电流是L型钙电流(P<0.01)。DD(3 μmol/L)明显抑制 ICa-L,peak(P<0.01)。(2)DD对ICa-L的浓度依赖性:探究DD在0.1、0.3、1、3、10μmol/L浓度下对心室肌细胞 ICa-L 的作用。DD(0.1μmol/L)对 ICa-L影响微弱,而 DD(0.3、1、3、10μmol/L)使得大鼠心室肌细胞 ICa-L从给药前(-17.39±0.61)pA/pF 分别降至(-11.44±0.67)pA/pF、(-9.53±1.58)pA/pF、(-6.70±0.65)pA/pF 和(-2.45±0.54)pA/pF;与对照组相比,低浓度 0.3、1μmol/LDD就具备抑制效果,且效果明显(P<0.05),提示DD呈浓度依赖性抑制L型钙通道电流,随浓度增加,抑制作用愈强。待电流趋于稳定后,用细胞外液冲洗后,ICa-L电流逐渐恢复到给药前水平提示DD对ICa-L的作用是可逆的的。(3)DD对ICa-L的电流-电压(Ⅰ-Ⅴ)曲线:当DD(1-10μmol/L)作用后,ICa-L和电流密度逐渐减少。Ⅰ-Ⅴ曲线在(-20-+20mV)电压范围下随电流密度降低而显著上移。而Ⅰ-Ⅴ曲线形态以及反转电位并没有明显变化。(4)DD对ICa-L的激活和失活动力学:ICa-L的激活曲线和失活曲线随DD浓度越高显著均向超极化方向移动。给药前以及各浓度DD(1-10 μmol/L)的激活曲线的半最大激活电压V1/2 和斜率因子 k 分别为(-9.13±0.57)mV/(4.52 ± 0.55)、(-14.10±0.65)mV/(4.70±0.54)、(-20.17±1.55)mV/(5.00±1.44)、(-28.76±1.44)mV/(4.80±1.33)(P<0.05),说明 DD 可加快 L型钙通道激活。给药前以及各浓度DD的激活曲线的半最大失活电压V1/2斜率因子和k分别为(-19.82±0.55)mV/(14.11±0.49)、(-30.21±0.70)mV/(16.29±0.63)、(-42.61±1.00)mV/(15.77±0.92)和(-52.83±1.16)mV/(12.66±1.08)(P<0.05),表明该药物加快了L型钙通道的失活。(5)DD对ICa-L失活后恢复曲线:DD使ICa-L的失活后恢复曲线右移,而1μmol/L DD使τ由给药前(10.50±0.45)ms 变为(16.75±0.65)ms;同样给予 3、10μmol/LD 后,τ为(21.50±0.73)ms和(29.00±1.07)ms,恢复时间呈明显延长(P<0.05)。结果表明,DD呈浓度依赖性延长ICa-L从失活态向激活态转变的时间。结论:DD以浓度依赖性阻滞瞬时外向钾通道;对钠通道和L型钙通道均可以浓度依赖和改变动力学特征阻滞,这些结果可能是DD保护心脏保护的作用机制。