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目的:观察慢性肾衰竭(chronic renal failure,CRF)湿热证患者外周血单个核细胞中p38、p-p38、细胞外信号调节激酶5(BMK1/ERK5)及p-ERK5的表达及清肾颗粒对上述指标的干预作用。方法:70例慢性肾衰竭患者随机分为治疗组和对照组,每组各35例,并设正常组30例(检测外周血单个核细胞中p38、ERK5及其磷酸化蛋白的表达情况)。疗程结束时,治疗组32例(剔除3例,因加用金水宝1例、百令胶囊1例、无故自行停药1例),对照组32例(剔除3例,因加用百令胶囊1例、尿毒清颗粒2例)。两组受试者同时接受中药保留灌肠和基础治疗,治疗组患者加用清肾颗粒口服,一天3次,一次1包,疗程12周。观察两组患者治疗前后血肌酐(serumcreatinine,Scr)、p38、p-p38、ERK5、p-ERK5,估算肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate,eGFR)的变化情况。结果:1.临床疾病疗效:治疗组总有效率为81.25%,对照组为53.13%,两组相比较,差异有统计学意义(P<0.05)。2.中医证候疗效:治疗组总有效率为84.38%,对照组为56.25%,两组相比较,差异有统计学意义(P<0.05)。3.血肌酐:两组患者治疗前血肌酐比较差异无统计学意义(P>0.05);12周后,治疗组患者血肌酐较治疗前明显下降(P<0.01),与同期对照组比较也明显下降(P<0.01);对照组患者12周后血肌酐与治疗前相比差异无统计学意义(P>0.05)。4.eGFR:治疗前两组患者相比差异无统计学意义(P>0.05);12周后,治疗组患者eGFR较治疗前明显升高(P<0.01),与同期对照组相比明显升高(P<0.01);对照组患者12周后eGFR与治疗前相比差异无统计学意义(P>0.05)。5.治疗前,两组患者血清p38、p-p38、ERK5、p-ERK5水平均显著高于正常组(P<0.01),治疗组患者p38、p-p38、ERK5、p-ERK5水平与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05);治疗组患者治疗后p38、p-p38、ERK5、p-ERK5水平与治疗前相比下降明显(P<0.01),与同期对照组比较明显下降(P<0.01);对照组患者p38、p-p38、ERK5、p-ERK5水平治疗前后差异无统计学意义(P>0.05)。6.安全性分析:治疗组患者12周后血、尿、粪及肝功能、心电图等各项检查与治疗前相比无明显变化。结论:1.慢性肾衰竭湿热证患者外周血单个核细胞中p38、p-p38、ERK5、p-ERK5水平均升高。2.清肾颗粒能够减轻慢性肾衰竭湿热证患者的临床表现,改善肾功能。3.清肾颗粒可以降低慢性肾衰竭湿热证患者p38及ERK5的表达。4.治疗组患者在服用清肾颗粒治疗期间未出现不良反应,说明该药安全、有效。目的:检测5/6肾切除肾纤维化大鼠肾脏组织中P38、p-p38、ERK5、p-ERK 5蛋白的表达情况并探讨上述指标与肾纤维化的关系;观察不同剂量清肾颗粒是否能通过降低p38MAPK、ERK5 MAPK信号通路活性发挥抗肾纤维化的作用。方法:选用雄性SD大鼠72只,2月龄,清洁级,体重200±20g,全部购自安徽医科大学实验动物中心,封闭管理,适应性饲养1周。1周后以单纯随机抽样法,随机分为6组,分别为正常组、模型组、清肾颗粒高、中、低剂量组、氯沙坦组各12只。除正常组12只大鼠外,模型组60只大鼠均制备5/6肾切除模型;各组动物均在造模后第1天开始给药,每日1次,每次2ml,清肾颗粒高剂量组、中剂量组、低剂量组分别给予清肾颗粒水溶液按4.0g/kg·d、8.0g/kg·d和16.0g/kg·d灌胃;氯沙坦组将氯沙坦钾片(50mg/片)混悬液按13mg/kg·d灌胃。正常组及模型组均给予等量生理盐水灌胃。各组连续给药12周。检测血肌酐(serum Creatinine,Scr)、内生肌酐清除率(Creatinine Clearance,Ccr)、血尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)、24小时尿蛋白定量(24-hoururine protein,24h Upro)及尿肌酐(urine creatinine,Ucr);Western blot法检测肾脏组织中P38、p-p38、ERK5、p-ERK 5的蛋白表达;HE染色、masson染色、PAS染色观察6组大鼠肾脏组织病理改变;将相应蛋白进行免疫荧光双标,然后用激光共聚焦显微镜扫描成像观察蛋白的表达情况。结果:1.Scr、BUN、24h Upro:模型组与正常组相比差异有统计学意义(P<0.01);清肾颗粒各剂量组、氯沙坦组和模型组大鼠相比差异有统计学意义(P<0.01);清肾颗粒各剂量组之间差别明显(P<0.01),其中高剂量组最低;清肾颗粒高剂量组与氯沙坦组相比显著下降(P<0.01);清肾颗粒中、低剂量组与氯沙坦组比较无明显差异(P>0.05)。2.Ccr:模型组与正常组比较明显下降(P<0.01);清肾颗粒各剂量组、氯沙坦组与模型组比较均有所升高(P<0.01);清肾颗粒各剂量组之间差别明显(P<0.01),其中高剂量组水平最高;清肾颗粒中、低剂量组与氯沙坦组相比较无明显差异(P>0.05),清肾颗粒高组大鼠Ccr水平与氯沙坦组相比较明显升高(P<0.01)。3.P38、p-p38、ERK5、p-ERK 5蛋白表达情况(Western blot法):⑴P38、ERK5:模型组大鼠P38、ERK5表达与正常组比较升高明显(P<0.01);清肾颗粒各剂量组与模型组比较,P38、ERK5表达明显降低(P<0.01);清肾颗粒各剂量组与氯沙坦组之间比较差异不明显(P>0.05)。⑵p-p38、p-ERK 5:模型组大鼠p-p38、p-ERK 5表达较正常组明显升高(P<0.01);清肾颗粒各剂量组及氯沙坦组大鼠与模型组比较,p-p38、p-ERK 5表达明显下降(P<0.01);清肾颗粒各剂量组比较,高剂量组的p-p38、p-ERK 5表达最低;高剂量组p-ERK 5、p-p38表达与氯沙坦组比较下降明显(P<0.01),清肾颗粒中、低剂量组p-ERK 5、p-p38表达与氯沙坦组大鼠相比较无明显差异(P>0.05)。4.免疫荧光双染检测CD31与p-p38、CD31与p-ERK5蛋白表达情况(激光共聚焦显微镜扫描成像):⑴CD31+p-p38:p-p38在正常组没有表达,模型组可见明显表达;清肾颗粒各剂量组及氯沙坦组较模型组表达均有不同程度下降,其中高剂量组表达最少;清肾颗粒中、低剂量组与氯沙坦组表达无明显差异。⑵CD31+p-ERK5:p-ERK5在正常组没有表达,模型组可见明显表达;清肾颗粒各剂量组及氯沙坦组较模型组表达均有不同程度下降,其中高剂量组表达最少;清肾颗粒中、低剂量组与氯沙坦组表达无明显差异。5.各组大鼠肾脏病理形态学变化:正常组大鼠肾脏的病理结构无异常;模型组大鼠肾小管上皮细胞脱落、空泡变性,管腔扩张,肾间质大量炎性细胞浸润,蓝染胶原纤维大量堆积,肾小球大小形态不一,可见系膜细胞增生、基质增多,部分可见局灶性肾小球硬化。与模型组比较,各治疗组大鼠上述病理改变明显减轻,尤以清肾颗粒高剂量组大鼠明显。结论:1.p38MAPK及ERK5 MAPK信号通路的活化参与肾纤维化的形成过程;2.清肾颗粒能够降低肾纤维化大鼠的Scr、BUN水平,消减尿蛋白,提高Ccr;3.清肾颗粒可减轻肾纤维化大鼠肾脏组织的病理损害程度;4.清肾颗粒可降低肾纤维化大鼠肾组织中p38、p-p38、ERK5、p-ERK5的蛋白表达水平,通过抑制p38及ERK5信号通路的活化从而达到延缓RIF的作用。