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近20年来,尽管乳腺癌的治疗手段在不断提高,但仍是威胁女性生命的重大疾病之一。藤黄酸是从藤黄树脂中分离出来的一种化合物,具有较强的体内外抗肿瘤作用,其分子式为C38H44O8,分子量为628.75。研究表明藤黄酸具有杀死肿瘤细胞及抑制肿瘤转移双重作用,是有效的抗肿瘤药物之一。尽管目前已经对藤黄酸的抗肿瘤作用进行了大量的研究,但藤黄酸作用于乳腺癌细胞的蛋白质组学研究尚未报导。本实验以MDA-MB-231细胞为受试对象,首先通过细胞毒实验、迁移实验及黏附实验考察了藤黄酸的细胞毒作用及抑制肿瘤转移作用,随后运用蛋白质组学方法寻找其抗肿瘤作用的可能相关靶点,最后用Western blotting及Immunofluorescence Confocal Microscopy对部分差异表达蛋白进行验证。
MTT实验结果显示,藤黄酸作用24 h,48 h可以有效抑制MDA-MB-231细胞的生长活力,并随浓度呈依赖性抑制作用,其IC50分别为2.80±0.43μM和2.41±0.10μM。细胞周期和凋亡实验结果显示,1.0μM,1.5μM藤黄酸作用于细胞24 h可以显著诱导G2/M期周期阻滞,诱导细胞凋亡。划痕实验、小室迁移实验、黏附实验结果显示,0.5μM,0.75μM藤黄酸可以显著抑制MDA-MB-231细胞的迁移和黏附,浓度越高抑制作用越明显。用2.0μM藤黄酸或DMSO处理MDA-MB-231细胞3 h,24 h后,分别提取细胞总蛋白进行双向电泳,用PDQuest软件对蛋白质表达图谱进行分析,并采用基质辅助激光解吸飞行时间质谱对差异表达的蛋白质进行了鉴定。共鉴定到23个差异表达蛋白,其中上调的蛋白有16个,分别为内质网蛋白29(Endoplasmic reticulum protein ERp29)、3-羟基异丁酸脱氢酶(3-hydroxyisobutyrate)、5磷酸吡哆胺氧化酶(Pyridoxine-5-phosphate oxidase)、3,2反式烯脂酰辅酶A异构酶(3,2-trans-enoyl-CoA isomerase)、NADH脱氢酶[泛醌]铁硫蛋白3(NADH dehydrogenase[ubiquinone]iron-sulfur protein3)、真核翻译起始因子6(Eukaryotic translation initiation factor 6,eIF6)、泛素羧基末端水解酶同工酶L3(Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L3)、尿嘧啶脱氧核糖核苷三磷酸酶(Deoxyuridine 5-triphosphate nucleotidohydrolase,dUTPase)、波形蛋白(Vimentin)、泛素结合酶E2变体蛋白1(Ubiquitin-conjugating enzyme E2 variant １,UBE2V1)、骨架蛋白18(Keratin,typeI cytoskeleton 18)、肌动蛋白(Actin)、γ-可溶性NSF连接蛋白(Gamma-soluble NSF attachment protein)、蛋白二硫化物异构酶A3(Protein disulfide-isomerase A3,PDIA3)、丙酮酸激酶异构体(Pyruvate kinase,muscle,isoform CRA_c)、ATP合酶d亚基(ATP synthase subunit d);下调的蛋白有7个,分别为新生多肽相关复合体α(Nascent polypeptide-associated complex subunit alpha,NAC-α)、14-3-30(14-3-3 protein theta)、组蛋白H2A(Histone H2A type 1-A)、钙结合蛋白(Calumenin)、含蛋白质60锚蛋白重复域(Ankyrin repeat domain-containing protein 60)、白介素18(Interleukin 18,IL-18)、富谷氨酸SH3结构域结合蛋白3(SH3 domain-binding glutamic acid-rich-like protein 3)。这些蛋白大多数与肿瘤的发生发展相关,参与细胞的能量代谢、细胞骨架、转录翻译、应激反应等过程,是藤黄酸抗肿瘤作用的可能相关靶点。Vimentin和Keratin 18是其中两个差异表达的骨架蛋白,都属于中间纤维蛋白,与肿瘤细胞的增殖及肿瘤转移密切相关。采用Western blotting对Vimentin和Keratin 18进行了表达量的验证,结果显示其变化趋势与双向电泳的变化趋势一致。通过激光共聚焦显微镜观察技术发现,藤黄酸作用3 h后,Vimentin已经发生了变化,表明藤黄酸作用3 h已经对细胞骨架产生了影响,Vimentin等细胞骨架蛋白在藤黄酸的细胞毒作用和迁移抑制作用中可能起着重要作用。