背景G蛋白偶联受体39(G protein-coupled receptor39,GPR39)是一种视紫红质样G蛋白偶联受体,根据其氨基酸序列也被归为胃饥饿素(Ghrelin)受体家族的一员,由462个氨基酸残基构成,具有7个跨膜结构域,表达于所有的脊椎动物中。1997年Mc Kee教授等第一次从人类胎儿大脑c DNA中克隆出GPR39和GPR38。最初的报告显示这些新型的G蛋白偶联受体与饥饿素和神经降压素(Neurotensin)受体有关。GPR39主要表达于胃肠道、肝、脂肪组织和胰腺,此外在中枢神经系统也有广泛表达,如杏仁核、海马等,这些部位同时也是锌富集的区域,提示锌在中枢的神经递质作用可能和GPR39有关。相关研究也显示海马CA3区谷氨酸能终端释放的锌可激活突触后膜的GPR39受体,并调节情绪和认知。近来研究进一步证实缺锌可以导致GPR39表达下降,前额皮质GPR39减少与强迫游泳不动时间增加相关。研究发现,选择性抗抑郁药物,如依他普仑、瑞波西汀、安非他酮等可以增加GPR39的表达。越来越多的证据提示GPR39可能具有抗抑郁作用,但其具体的机制仍未完全阐明。抑郁症是多因素引起的精神障碍性疾病,患者主要表现为自尊感低、免疫系统功能紊乱、食欲减退、并伴随着社交障碍、工作效率下降、社会心理脆弱和生活质量和幸福感下降。抑郁症的特点是改变人的情绪和认知功能甚至使患者反复产生死亡或自杀的想法。中国每年有20万人因抑郁症自杀,不仅给患者自己而且给家人都带来了巨大的身心折磨。然而至今抑郁症病因和发病机制都未完全阐明。但可以肯定,生物、心理以及环境等多因素参与了抑郁症的发病过程。实验研究发现,慢性应激诱导抑郁发生与大脑神经元和神经胶质细胞萎缩和凋亡有关,应激大鼠海马萎缩、神经元形态改变并大量缺失、神经生长因子表达减少、记忆与认知功能下降。机体应激时,下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamic-pituitary-adrenal axis,HPA)被激活并分泌大量糖皮质激素(Glucocorticoids,GC)结合靶器官上的糖皮质激素受体发挥作用。而海马富含糖皮质激素受体,因此是应激时最容易受损的脑区。鼠类糖皮质激素主要是皮质酮。课题组既往实验运用皮质酮干预海马神经细胞后发现,细胞数量减少、细胞肿胀、排列紊乱、间隙增大、尼氏质减少;而对照组细胞排列整齐、密集、胞浆中清晰可见尼氏质。实验研究表明,应激导致神经元损伤,抑制神经元再生;从而导致神经元萎缩、减少、海马结构和功能受损等与抑郁的发生密切相关。海马是中枢神经系统中锌含量最为丰富的区域,而海马与学习、记忆以及行为和情绪密切相关。我们既往研究显示,应激可诱导海马锌稳态的紊乱,并且可以导致动物行为学发生抑郁样的变化,并发现有抑郁样行为改变的小鼠海马GPR39 m RNA表达明显减少。实验研究发现GPR39基因敲除小鼠模型呈现出抑郁样行为改变,海马环磷腺苷反应元件结合蛋白(c AMP response element binding protein,CREB)、脑源性神经营养因子(Brain derived neurotrophic factor,BDNF)水平降低,给予抗抑郁药治疗后BDNF蛋白水平上调,这可能与GPR39表达上调有关。CREB是一种核内蛋白,在体内主要调节基因的转录,因此也称为调节转录核因子。研究表明,CREB可以调控海马内基因转录,有利于海马长时程记忆的形成。此外,CREB是诱导BDNF产生的转录因子,CREB-BDNF这一通路对神经生长发育具有重要作用,并与神经和情绪障碍疾病如焦虑和抑郁等密切相关。BDNF在神经系统内广泛分布,在维持神经元存活和促进突触生长的过程中具有重要作用。因此,我们推测GPR39调控的CREB-BDNF信号通路可能是其神经保护作用途径之一。综上所述,我们发现慢性应激引起锌稳态紊乱诱导海马神经元凋亡增加,在抑郁的发生发展中起到了重要作用,且抑郁样行为改变的小鼠海马GPR39m RNA表达降低,近来研究进一步发现缺锌可以导致GPR39表达下降。因此应激致海马锌稳态紊乱可能是应激致抑郁样行为变化的物质基础,而应激致脑区海马神经细胞损伤可能是抑郁障碍的病理学基础,我们推测锌可能通过激活GPR39受体,进而调节与神经生长发育密切相关的CREB-BDNF信号通路和细胞凋亡信号通路发挥作用。实验目的通过观察HT-22细胞中GPR39的表达与锌离子之间的关系,并应用皮质酮处理HT-22细胞,检测皮质酮对小鼠海马神经细胞活性、线粒体膜电位和细胞凋亡的影响;培养体系内加入GPR39激动剂或转染GPR39 Si RNA,观察其在皮质酮致神经元损伤中的作用,并进一步对CREB-BDNF和凋亡信号通路进行分析。从而阐明锌受体GPR39神经保护作用及机制,为抑郁症的的防治提供新的实验基础和理论依据。实验方法1、细胞培养小鼠海马HT-22细胞,由David Schubert教授(加拿大,沙克研究所)馈赠。37℃、5%CO2的条件下,用含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM高糖培养基常规培养HT-22细胞。2、细胞干预(1)采用浓度梯度的硫酸锌(0μΜ、25μΜ、50μΜ、100μΜ、200μΜ)处理细胞6h和50μΜ硫酸锌按时间曲线(0 h、3h、6h、12h、18h、24h)处理HT-22细胞;硫酸锌干预HT-22细胞30min后,10μΜTPEN和DTPA干预HT-22细胞6h。(2)10μΜ浓度CORT按时间曲线(0h、3h、6h、12h、24h)和浓度梯度CORT(0n M、500n M、1μΜ、10μΜ、50μΜ)处理HT-22细胞6h。(3)采用0.5μΜ浓度GPR39激动剂(TCG-1008)按时间曲线(0h、3h、6h、12h、24h)和浓度梯度TCG-1008(0μΜ、0.1μΜ、0.25μΜ、0.5μΜ、1μΜ)处理HT-22细胞24h。3、细胞转染HT-22细胞接种培养板,当融合度为80%时,按说明书进行转染,将GPR39干扰小RNA以及转染试剂lipofctamine2000分别用DMEM稀释后混匀,37℃、5%CO2的条件下静置20min。每孔预先加入配制好的培养基(不含抗生素),再加入上述混合液。一般6h换液,继续培养至24h,进行后续实验。4、HT-22细胞活性的测定采用CCK-8试剂盒检测HT-22细胞活性。5、线粒体膜电位的测定采用JC-1试剂盒检测HT-22细胞线粒体膜电位。6、细胞凋亡的测定采用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测HT-22细胞凋亡情况。用RIPA裂解液提取HT-22细胞的总蛋白,热变性10min。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳2h,转膜1.5h,5%牛奶封闭2h,孵育一抗过夜,漂洗8-10min×3次,二抗孵育2h,漂洗后显影。8、实时定量荧光PCRTrizol提取HT-22细胞总RNA并定量,用反转录试剂盒将提取好的RNA反转录成c DNA。以c DNA为模板,与水、SYBRgreen以及引物混匀后,扩增。9、统计方法SPSS16.0进行数据分析,采用单因素方差分析(one-way ANVOA)和两独立样本t检验进行每组之间的比较,多组间两两比较采用SNK-q、Dunnett’s检验。设置显著性水平为P<0.05,P<0.01为非常显著性水平。实验结果1、锌对HT-22细胞GPR39表达的影响50μΜ硫酸锌分别干预HT-22细胞不同时间,结果发现3h组和6h组GPR39表达显著升高(P<0.05);用25μM、50μM、100μM和200μM硫酸锌分别干预HT-22细胞6h发现,50μM硫酸锌干预后GPR39表达显著增加(P<0.05);给予10μM TPEN和DTPA干预HT-22细胞,与对照组相比,单独给予锌离子螯合剂TPEN组和DTPA组GPR39蛋白表达显著降低(P<0.01);而与TPEN组和DTPA组相比,Zn2++TPEN和Zn2++DTPA组GPR39表达显著增加(P<0.05)。2、CORT对HT-22细胞活性的影响结果显示,与对照组相比,1μΜ、10μΜ和50μΜ组细胞活性显著减弱(P<0.05);使用500nΜCORT干预HT-22细胞不同时间,与对照组相比,12h、24h组细胞活性显著减弱(P<0.01)。3、干扰和激活GPR39对皮质酮处理HT-22细胞活性的影响实验结果发现,与对照组相比,500n M CORT干预对细胞活性没有影响(P>0.05),而干扰GPR39表达后,与500n M CORT组相比,Si RNA+500n M CORT组细胞活性明显降低(P<0.05)。与空白对照组相比,Si组与1μΜCORT组细胞活性显著降低(P<0.01);而给予0.5μΜGPR39激动剂(TCG-1008)后,7、Western-blot与Si组相比Si RNA+TCG-1008组细胞活性水平升高(P<0.05);与1μΜCORT组相比,1μΜCORT+TCG-1008组细胞活性水平升高(P<0.01)。4、干扰和激活GPR39对皮质酮处理HT-22细胞凋亡的影响实验结果表明,与对照组相比,500n M CORT组无明显变化,与500n M CORT组相比,Si RNA+500n M CORT组细胞凋亡明显增加(P<0.001)。与对照组相比,1μΜCORT组细胞凋亡显著增加(P<0.001);而与1μΜCORT组相比,给予GPR9激动剂TCG-1008后,1μΜCORT+TCG-1008组凋亡显著下降(P<0.001)并恢复至对照水平。5、干扰和激活GPR39对皮质酮干预HT-22细胞线粒体膜电位的影响与对照组相比,500n M CORT组线粒体膜电位无明显变化,与500n M CORT组相比,Si RNA+500n M CORT组线粒体膜电位明显下降(P<0.001)。与对照组相比,1μΜCORT组线粒体膜电位显著下降(P<0.001);而与1μΜCORT组相比,给予GPR9激动剂TCG-1008后,1μΜCORT+TCG-1008组线粒体膜电位显著升高(P<0.001)并恢复至对照水平。6、硫酸锌对HT-22细胞CREB和BDNF表达的影响与对照相比,50μM硫酸锌可以促进CREB和BDNF m RNA和蛋白表达增加(P<0.05)而200μM硫酸锌组CREB和BDNF m RNA和蛋白表达明显减少(P<0.05)。7、皮质酮对HT-22细胞GPR39及CREB-BDNF信号通路的影响不同浓度CORT处理HT-22细胞,结果显示,与对照相比,500n M CORT组GPR39表达显著增加(P<0.05),1μM、25μM和50μM CORT组GPR39表达显著下降(P<0.05);CREB和BDNF表达变化与GPR39一致。8、干扰和激活GPR39对CREB-BDNF信号通路的影响实验结果显示,干扰组CREB和BDNF表达均显著降低(P<0.01),而0.5μM TCG-1008干预HT-22细胞24h,发现CREB、BDNF m RNA和蛋白水平都有显著增加(P<0.05)。9、干扰和激活GPR39对细胞凋亡信号通路的影响结果显示,与对照组相比,500n M CORT组Caspase3、Caspase9、AIF以及BAX m RNA表达无明显变化,而Bcl-2 m RNA表达显著增加(P<0.01);而与500n M CORT组相比,Si+500n M CORT组Caspase3、Caspase9、AIF以及BAX m RNA表达显著增加(P<0.01),Bcl-2 m RNA表达明显降低(P<0.01)。与1μM CORT组相比,1μM CORT+TCG-1008组Caspase3、Caspase9、AIF以及BAX m RNA表达显著降低(P<0.01),Bcl-2 m RNA表达显著增加(P<0.01)。结论本研究首次对锌受体GPR39在小鼠海马HT-22细胞中的神经保护作用及其可能机制进行系统的研究,通过CORT处理HT-22细胞,观察应激对细胞活性、线粒体功能以及细胞凋亡等方面的影响;通过干扰和激活GPR39,观察其在细胞应激时的作用,并进一步对其作用机制进行探讨。主要结论如下:1、锌作为GPR39的配体,能够激活GPR39并促进其表达增加。2、GPR39对皮质酮所致的HT-22细胞损伤具有保护作用。3、GPR39可能通过促进CREB-BDNF表达和抑制促凋亡蛋白BAX、Caspase3、Caspase9以及AIF表达,上调抗凋亡蛋白Bcl-2表达发挥神经保护作用。