水稻鞘氨醇激酶OsSPK1的克隆鉴定与功能分析

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鞘脂普遍存在于包括植物在内的各种真核生物的生物膜中。鞘脂及其衍生物在生物体内参与了极重要的细胞功能,它们可以作为第二信使调控细胞生长、分化、存活、增殖和程序性死亡等。近年来,1-磷酸鞘氨醇作为细胞外递质和胞内第二信使的功能受到关注。细胞内的SPP水平高低是由其合成、分解和转运到胞外这三者相互作用调控,其中鞘氨醇激酶催化鞘氨醇形成1-磷酸鞘氨醇,1-磷酸鞘氨醇磷酸酶催化1-磷酸鞘氨醇还原为鞘氨醇,同时1-磷酸鞘氨醇裂解酶将1-磷酸鞘氨醇分解。为探讨SPP在植物抗逆反应中的作用,我们克隆得到水稻中编码鞘氨醇激酶的基因,OsSPK1,并通过转基因烟草分析了OsSPK1在抗病反应中的功能。 以水稻cDNA文库为模板,PCR扩增得到了水稻SPK基因OsSPK1全长cDNA。OsSPK1全长cDNA序列为2910bp,含有一个2247bp的ORF区域,预测编码一个757个氨基酸组成的SPK蛋白,推测的分子量为83.27kDa,等电点为7.4。OsSPK1基因位于水稻10号染色体上,含有8外显子和7个内含子。根据水稻OsSPK1基因氨基酸序列与人类、老鼠、酵母、线虫和植物中的SPKs家族的氨基酸序列进行比对分析,我们发现都包含一个125aa左右的保守DAGK催化结构域。同样,OsSPK1氨基酸序列还含有保守的C1~C4保守结构域。在C1结构域中的GXGX基序是这类鞘脂激酶的ATP结合位点。 为了进一步明确OsSPK1在水稻抗病性中的作用,我们将OsSPK1基因编码区置于植物双元载体CHF3pp2p212中CaMV 35S组成型强表达启动子的下游,运用根癌农杆菌介导的叶盘法转化烟草,经卡那霉素抗性筛选和PCR检测获得14株OsSPK1转基因植株。RT-PCR分析表明,转基因T1代烟草植株都正常表达OsSPK1基因。抗病性测定表明,过量表达OsSPK1的转基因烟草植株提高了对烟草黑胫病菌(Phytophthora parasitica var.nicotianae)和烟草野火病(Pseudomonas syringae pv.tabaci)的抗病性。
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