肿瘤细胞中YIPF2调控TNFRSF10B的分子机制

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研究目的TRAIL受体,又称为死亡受体,在细胞外源性凋亡通路中发挥重要作用。TRAIL-R2,又称为TNFRSF10B或DR5,被激活后向下游CASP级联反应传递凋亡信号。TNFRSF10B向质膜的转运是其发挥功能所必需的。YIPF2(YIP1 Protein Family member 2)属于YIP1家族蛋白,主要分布于内质网和高尔基体,有可能在膜泡运输中发挥作用。我们在前期研究中发现,YIPF2的转录水平在化疗药物处理的人非小细胞肺癌细胞中明显上调。同时,这些处理诱导TNFRSF10B上调并引起细胞凋亡。本课题的研究目的是,探究YIPF2在TNFRSF10B于细胞内组分间运输中的作用以及对化疗药物诱导的细胞凋亡的调控作用。研究方法1.使用Western Blot检测YIPF2和TNFRSF10B的表达水平在化疗药物处理的人非小细胞肺癌细胞内的变化。2.在人非小细胞肺癌细胞中使用基因沉默或质粒转染敲低或过表达YIPF2后,使用化疗药物pemetrexed(PEM)进行处理。使用Western Blot检测TNFRSF10B的表达水平以及下游CASP级联反应的活化,并使用流式细胞术检测细胞凋亡。使用荧光共聚焦显微镜和流式细胞术检测TNFRSF10B在质膜上的分布。3.使用蛋白质免疫共沉淀实验检测YIPF2与TNFRSF10B的结合情况。4.在人非小细胞肺癌细胞中使用基因沉默或质粒转染敲低或过表达YIPF2后,进行和2.中相同的处理和实验,寻找在YIPF2调控TNFRSF10B的膜泡运输中发挥作用的RAB蛋白。5.使用蛋白质免疫共沉淀实验确定YIPF2-TNFRSF10B复合物中所包含的RAB蛋白。实验结果1.YIPF2在化疗药物处理的人非小细胞肺癌细胞中的表达增加,呈浓度和时间依赖性,并早于TNFRSF10B的上调。2.在人非小细胞肺癌细胞中敲低或过表达YIPF2,分别减轻或增强化疗药物诱导的TNFRSF10B上调和由其导致的细胞凋亡。3. YIPF2与TNFRSF10B在人非小细胞肺癌细胞内结合并在胞质共定位。4. RAB8与YIPF2-TNFRSF10B复合物结合并被YIPF2负调控。5.RAB8负调控YIPF2和TNFRSF10B的表达水平、TfNFRSF10B在质膜上的分布以及化疗药物诱导的细胞凋亡。6. YIPF2正调控RAB18, RAB18也正调控TTNFRSF10B的表达向质膜的转运。7. YIPF2负调控RAB40c, RAB40c也负调控YIPF2和TNFRSF10B的表达。实验结论1. YIPF2调控TNFRSF10B的表达和膜泡运输。2. YIPF2通过调控TNFRSF10B调控肿瘤细胞凋亡。3. RAB8、RAB18和RAB40c参与到YIPF2对TNFRSF10B调控中。
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