乳腺癌是全球女性中第二大最常见的恶性肿瘤。根据全球2018年癌症统计数据,占所有癌症病例的四分之一。乳腺癌主要发生在50岁以上的中老年妇女中,其发病比例为10%^[1]。三阴性乳腺癌（TNBC）是乳腺癌的一种亚型,是缺乏雌激素受体（ER）,孕激素受体（PR）和人类表皮生长因子受体2（HER-2）的恶性乳腺癌的一种特殊类型。TNBC占乳腺癌的16%。它的发病年龄比其他乳腺癌的发病年龄小,63%的TNBC患者年龄小于50岁,TNBC较其他乳腺癌更具有侵袭性、易转移性,治疗后3年复发率和5年死亡率较高^[2-3]。由于缺乏ER、PR和HER2,造成TNBC快速转移和对化疗药物的敏感性。TNBC在分子水平,病理学和临床特征上的异质性还导致其对不同化疗药物的敏感性不同,使TNBC细胞分化差,恶性程度高,缺乏分子的靶向机制。目前化疗是临床术后治疗TNBC的主要治疗手段,但其治愈率低,易产生耐药性^[4]。吉西他滨（Gem;Gemcitabine）常作为一线治疗药物,但会出现耐药性,一定程度上限制了其在临床上的更好应用,但Gem与其他抗肿瘤药物等联合应用的治疗方案;已经被临床上确定为复发或转移性乳腺癌病人治疗方案之一^[5]。TNBC的乳腺癌亚型最常与缺氧有关,许多研究表明转录因子HIF-1α（hypoxia inducible factor-1）是缺氧反应的重要中介之一,对肿瘤的转移和发展有促进作用^[6]。HIF-1α可以激活多种缺氧反应基因的转录,其中VEGF（vascular endothelial growth factor VEGF）是HIF-1α为影响最大的血管生成生长因子,VEGF介导HIF-1α驱动的血管生成^[7]。许多肿瘤的生长都需要新生血管来供血,而VEGF又跟血管生长息息相关。因此,低氧性癌细胞具有侵袭性和转移性,以及对癌症治疗的耐药性,HIF-1α与VEGF这两者结合在一起构成致命的癌症表型^[8]。考虑到这些因素,应寻找能够抑制HIF-1α的抑制剂,达到抗癌的效果。研究证实,地高辛是HIF-1α的新抑制剂,它可以通过抑制癌细胞中HIF-1α蛋白和HIF-1α靶基因的合成来抑制肿瘤细胞的增殖,从而导致皮下裸鼠移植瘤生长停滞^[9]。研究发现中药玄参科植物毛地黄叶中提取的洋地黄制剂地高辛是一类新型的抗肿瘤靶向药物,可预防肿瘤的复发转移,逆转多药耐药性^[10-12]。化疗单一用药使人体对特定药物产生耐药性的几率较大,疗效不理想。两种抗肿瘤药物联合使用,可逆转肿瘤细胞耐药性,诱导肿瘤细胞凋亡,提高治疗效果,降低复发率。将化疗药物包裹在纳米胶囊中制成两种药物结合的纳米药物制剂,以提高药物生物利用度,减少药物剂量,减少药物对正常细胞的毒副作用,提高药物的治疗效果。在实验中采用复乳溶剂挥发法制备两药联合的地高辛与吉西他滨纳米制剂,从整体动物实验和细胞水平两个层次探讨地高辛联合吉西他滨纳米制剂对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231生物特性的影响,进而研究地高辛联合吉西他滨纳米制剂对MDA-MB-231细胞的抗肿瘤作用。目的探讨地高辛联合吉西他滨纳米制剂对体内外三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖及凋亡的影响,并揭示其发生的可能机制。方法1.地高辛与吉西他滨纳米制剂对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的影响:体外培养三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞,分为未处理的对照组、纳米囊组（PLGA）、Dig纳米囊组（PLGA-Dig 100nmol/L）、Gem纳米囊组（PLGA-Gem32umol/L）、Gem+Dig纳米囊组（PLGA-Gem-Dig 100nmol/L+32umol/L）。通过CCK-8法检测不同给药组对MDA-MB-231细胞活力的影响。利用流式细胞术定量考察药物对细胞凋亡率,细胞周期和线粒体膜电位的影响。透射电镜及Hoechst染色观察不同给药组对MDA-MB-231细胞形态产生的影响。免疫荧光法检测CD31和VEGF在不同组中对血管生成的影响。Western Blot检测MDA-MB-231细胞中Bax、Bcl-2、Caspase3、Cyt-C和HIF-1α蛋白的表达情况。2.地高辛与吉西他滨纳米制剂对三阴性乳腺癌MDA-MB-231裸鼠移植瘤的作用选用体重在20-22g的雌性BALB/c裸鼠。适应环境5天后,在裸鼠的右下肢皮下接种MDA-MB-231细胞,建立三阴性乳腺癌裸鼠移植瘤模型,一周左右后观察成瘤情况,成瘤成功后随机分为7组:对照组、PLGA组、PLGA-Dig组（2mg/kg）、PLGA-Gem组（5 mg/kg）和PLGA-Gem-Dig组（2mg/kg+5mg/kg）,每组6只,为了药物更好在体内循环吸收;采取尾静脉注射连续给药周期28天,给药组每周给药4次,模型组（生理盐水）和PLGA组（聚乳酸-羟基乙醇酸共聚物）给予相同体积。每周3次测量各组裸鼠体重及瘤体变化,依据其变化绘制移植瘤生长曲线。裸鼠30天后用颈椎脱臼的方法处死,取出瘤体、心、肝、脾、肺、肾并称重,放入分别5%甲醛固定液中。（1）计算每组裸鼠的肿瘤体积和肿瘤抑制率。（2）HE染色观察各组瘤体变化。（3）HE染色检测药物毒性对心、肝、脾、肺、肾的影响。（4）TUNEL染色检测药物对移植瘤凋亡情况的抑制（5）Ki-67检测对移植瘤增殖的作用（6）运用免疫组化法考察移植瘤HIF-1α和CD31及VEGF的蛋白表达变化情况。结果:1.地高辛与吉西他滨纳米制剂对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的影响CCK-8结果提示,与空白对照组比较,在不同时间下,各不同给药组使MDA-MB-231细胞活力降低,抑制细胞的增殖,与各个单药物相比,联合给药组效果最为显著,差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。Annexin V/PI双染结果表明,与空白对照组相比,PLGA-Gem、PLGA-Dig、PLGA-Gem-Dig组分别增加MDA-MB-231细胞凋亡率,PLGA-Gem-Dig凋亡率增加最明显。差异有统计学差异（P<0.05或P<0.01）。细胞周期结果显示,与空白对照组相比,PLGA-Gem、PLGA-Dig、PLGA-Gem-Dig组分别阻滞MDA-MB-231细胞G2/M期周期,抑制细胞的增殖,差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。JC-1染色结果提示,与空白对照组比较,PLGA-Gem、PLGA-Dig、PLGA-Gem-Dig给药组分别使MDA-MB-231细胞线粒体膜电位降低,JC-1所占比例减少,联合组减少尤为显著,差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。Hoechst及透射电镜结果提示,与空白对照组比较,PLGA-Gem、PLGA-Dig、PLGA-Gem-Dig给药组分别使细胞形态发生凋亡样改变,细胞核皱缩,核染色质浓染,给药组可见凋亡样及坏死样的变化;出现凋亡小体的形成。免疫荧光检测结果提示,与空白对照组相比,PLGA-Gem、PLGA-Dig、PLGA-Gem-Dig组分别使荧光强度明显降低,蛋白表达量下降。表明给药组可阻断肿瘤血管的生成。Western-Blot结果提示,与空白对照组比较,PLGA-Gem、PLGA-Dig、PLGA-Gem-Dig给药组分别上调促凋亡因子Bax、Cyt-C、Caspase3的表达,下调抗凋亡因子Bcl-2的表达,同时降低HIF-1α蛋白表达（P<0.05或P<0.01）。2.地高辛与吉西他滨纳米制剂对三阴性乳腺癌MDA-MB-231裸鼠移植瘤的作用2.1地高辛与吉西他滨纳米制剂对MDA-MB-231移植瘤裸鼠的体内毒性评价通过HE染色法观察裸鼠心、肝、脾、肺、肾的形态学变化,结果显示,未处理的对照组与PLGA组的心、肝、脾、肺、肾细胞形态完整、排列规则及血管分布均匀,细胞生长状态良好;溶液组的心、肝、脾、肺、肾都受到了明显的损伤,细胞形态损伤出现排列不规则;PLGA-Dig组、PLGA-Gem组、PLGA-Gem-Dig组对各个脏器无明显毒性作用,细胞生长状态良好对裸鼠各脏器几乎无毒,相比于溶液组具有显著的优势。2.2地高辛与吉西他滨纳米制剂对MDA-MB-231移植瘤裸鼠的影响移植瘤生长曲线与瘤体大小可得,与对照组相比,给药组肿瘤体积逐渐变小及生长速度减慢,地高辛与吉西他滨纳米制剂能够抑制裸鼠移植瘤瘤体的生长;HE染色可显示,与对照组相比,肿瘤细胞团体积明显减小,肿瘤细胞部分坏死,排列稀疏,Ki-67的表达下降,表明地高辛与吉西他滨纳米制剂抑制MDA-MB-231细胞裸鼠移植瘤的增殖。TUNEL检测显示,与对照组相比,给药组使肿瘤细胞中阳性细胞数升高,免疫组化检测显示可降低HIF-1α、VEGF蛋白的表达,并且减少CD31的微血管密度,表明地高辛与吉西他滨纳米制剂促进裸鼠MDA-MB-231移植瘤凋亡。结论:1.地高辛与吉西他滨纳米制剂可提高乳腺癌MDA-MB-231细胞的抑制增殖、促凋亡作用;阻滞周期的G2/M期,并且抑制裸鼠移植瘤的生长,诱导其肿瘤组织凋亡,两药联合效果更加显著。2.地高辛与吉西他滨纳米制剂影响乳腺癌恶性行为的机制可能与通过抑制HIF-1α,减少VEGF和CD31表达而抑制肿瘤微血管生成,减少肿瘤新生血管形成有关。同时调节凋亡蛋白,又破坏线粒体膜电位,导致细胞凋亡,这可能也是地高辛与吉西他滨纳米制剂诱导细胞凋亡的分子机制之一。