论文部分内容阅读
研究背景：糖尿病（特别是2型糖尿病）的发病率在全世界范围内急剧上升，而冠状动脉血管病变及由此引起的缺血性心脏病（IHD）是导致糖尿病患者死亡的主要原因。尽管经皮冠状动脉介入治疗术（Percutaneous coronary intervention, PCI）已经广泛开展，但是糖尿病人心梗后心功能恢复及预后仍比非糖尿病人差。因此，单纯用冠脉血流灌注差已不能解释糖尿病人心肌易损性增加这一现象。目前，糖尿病心肌细胞缺血/再灌注（MI/R）损伤易感性增加从而导致其死亡率增高的分子学机制尚不清楚。线粒体是细胞内能量代谢的枢纽，是凋亡的司令部。04年发表于NEJM的一项临床研究发现，2型糖尿病患者出现线粒体功能障碍1。而线粒体通过线粒体生物合成进行自我更新对于维持线粒体的完整性是十分重要的，这个过程的受损与包括衰老，神经退行性变以及2型糖尿病在内的多种疾病发生发展过程相关。具体到2型糖尿病而言，线粒体生物合成障碍将导致酶活性受损，细胞间脂质（IMCL）沉积，最终导致胰岛素抵抗，形成2型糖尿病2。因此，线粒体生物合成障碍被认为是2型糖尿病心肌损伤的重要原因之一。脂联素（APN）~3是脂肪细胞分泌的一种脂肪细胞因子.正常人血浆中脂联素含量丰富，但在肥胖症相关疾病包括冠脉疾病和2型糖尿病人血浆中水平明显降低。2004年发表的对超过18,000例男性患者所做的临床研究4发现，血浆脂联素水平与心肌梗死发病率呈明显负相关。近期研究结果强烈提示糖尿病人血浆脂联素降低可能是糖尿病患者IHD发病率增加的关键因素。Masato Iwabu等的研究5指出在骨骼肌中，脂联素的下游通路与线粒体生物合成有关。但脂联素发挥心肌保护作用是否通过线粒体生物合成，尚未见报道。研究目的：1.高糖高脂能否改变心肌细胞线粒体生物合成及功能？2.脂联素能否及通过何种途径影响高糖高脂导致的心肌细胞线粒体生物合成及功能变化？3.脂联素能否通过线粒体生物合成减轻高糖高脂诱导的心肌细胞缺氧复氧损伤？研究方法：1.培养NRVM5d后分为3组：即对照组（培养基中含5mmol/L葡萄糖和20mmol/L甘露醇)，高糖/高脂组(培养基中含25mmol/L葡萄糖和500μmol/L软脂酸钠）及高糖/高脂+APN组（培养基中含25mmol/L葡萄糖，500μmol/L软脂酸钠和3μg/mlAPN球状片段）。高糖/高脂处理后，观察细胞电镜结构变化，检测Tfam，NRF-1，PGC-1α的mRNA水平与PGC-1α的蛋白水平。2.培养NRVM5d后分为5组：即对照组，高糖/高脂组，高糖/高脂+APN组，高糖/高脂+APN+PGC-1α siRNA组与高糖/高脂+APN+Scrambled siRNA组（培养基浓度与1相同）。检测线粒体DNA水平，细胞ATP水平与线粒体膜电位变化。3.培养NRVM5d后分为5组：即对照组，高糖/高脂+缺氧复氧组，高糖/高脂+缺氧复氧+APN组，高糖/高脂+缺氧复氧+APN+PGC-1α siRNA组与高糖/高脂+缺氧复氧+APN+Scrambled siRNA组（培养基浓度与1相同），检测细胞凋亡。实验结果1.通过使用胰酶胶原酶混合消化法，成功分离培养乳鼠心肌细胞。正常培养5天后，可见相互接触并自发搏动的一层心肌细胞形成，搏动频率约为60～120次/min。2.通过使用高糖高脂培养基孵育乳鼠心肌细胞不同时间（6h，12h，18h），检测细胞NRF-1与PGC-1α的mRNA水平发现，两者均随着时间的增加而下降，18h时其mRNA水平下降最为明显，提示18h时线粒体生物合成下降最为明显。3.高糖高脂培养基孵育乳鼠心肌细胞18h后，提取细胞制作细胞电镜标本，透射电子显微镜镜下观察发现，线粒体形态发生明显改变：相较对照组而言，高糖高脂组线粒体变大变圆，基质变浅、嵴变短变少甚至消失。4.对高糖高脂孵育18h的乳鼠心肌细胞给予脂联素球状片段（gAd），检测NRF-1，PGC-1α与Tfam的mRNA水平发现，与对照组相比，高糖高脂组mRNA水平均明显下降(P<0.05)，高糖高脂+gAd组mRNA水平较高糖高脂组升高(P<0.05)，提示脂联素可以改善高糖高脂诱导的心肌细胞线粒体生物合成降低。5.使用PGC-1α的siRNA对乳鼠心肌细胞进行孵育，提取检测线粒体DNA（mtDNA）水平发现：同对照组相比，高糖高脂组的mtDNA水平并没有明显的变化，加入脂联素后，其mtDNA水平明显升高(P<0.05)，而在加入PGC-1α的siRNA后，这种升高作用明显减弱(P<0.05)，提示脂联素通过PGC-1α来提高心肌细胞线粒体生物合成的。6.使用JC-1检测试剂盒及ATP检测试剂盒分别检测乳鼠心肌细胞线粒体膜电位及细胞ATP含量。结果发现同对照组相比，高糖/高脂组乳鼠心肌细胞线粒体膜电位及ATP含量降低，线粒体功能下降。同高糖/高脂组相比，高糖/高脂+APN组线粒体膜电位及ATP含量升高，线粒体功能改善；而高糖/高脂+APN+PGC-1α siRNA组线粒体膜电位改善及ATP含量增加不明显，提示PGC-1α阻断后，APN的改善线粒体功能作用减弱。7.高糖/高脂孵育乳鼠心肌细胞18h后，对细胞进行缺氧、复氧（缺氧9h，复氧3h），检测细胞中Caspase-3的活性并进行TUNEL染色。结果表明，同对照相比，缺氧处理的细胞中Caspase-3的活性明显升高(P<0.05)；缺氧+APN可明显降低Caspase-3的活性(P<0.05)，但同缺氧+APN组相比，缺氧+APN+PGC-1α siRNA组的Caspase-3活性又出现升高(P<0.05)，TUNEL结果与Caspase-3结果保持一致，提示APN可减少高糖/高脂环境下细胞缺氧、复氧的损伤，而阻断PGC-1α可使这种保护作用减弱。结论：高糖高脂降低心肌细胞线粒体生物合成及功能。脂联素通过PGC-1α逆转高糖高脂导致的心肌细胞线粒体生物合成及功能下降，并减轻心肌细胞缺氧复氧损伤。