本文研究建立了孔雀石绿的免疫检测方法,研究内容主要包括:孔雀石绿半抗原的设计与合成,完全抗原的制备,多克隆抗体的制备及纯化,间接竞争酶联免疫方法的建立,实际样品的检测以及高效液相色谱法的验证实验。本课题以对甲酰基苯甲酸和N,N-二甲基苯胺为原料在无水氯化锌的催化作用下制备出中间体羧基化隐性孔雀石绿(CLMG),然后分别用四氯对苯醌氧化和二氧化铅两种氧化法合成半抗原羧基化孔雀石绿(CMG)。所得半抗原通过碳化二亚胺法分别与牛血清蛋白(BSA)和匙孔血蓝蛋白(KLH)两种蛋白载体偶联制备免疫原。通过免疫新西兰大耳白兔制备了孔雀石绿多克隆抗体,血清效价为1:64000,对于1000μg/L孔雀石绿标准品的抑制率为93%,抗体经protein A-Sepharose 4B亲和层析纯化。在抗体制备基础上通过条件优化,建立了孔雀石绿间接竞争酶联免疫吸附检测方法。最佳工作条件为:包被原的包被量为0.1 μg/well,抗体稀释倍数为8000倍,封闭液为0.5/%脱脂乳粉,样品稀释液为pH 7.4的0.01 M PBS。该方法的灵敏度IC50为. 2.17±0.32 μg/L,检出限IC15为0.061±0.009μg/L。抗体与结晶紫的交叉反应率为93%。实验选取了草鱼、鲤鱼、鲈鱼、鳕鱼、虾5种常见水产品进行实际样品的检测。经基质影响消除实验得出该抗体的样品检出限为2.4 μg/kg,经加标回收实验测得平均加标回收率在71.4%-86.8%之间,变异系数小于12.3%。所建立的ELISA检测结果经HPLC-MS/MS方法验证,二者检测结果相关性良好,证明所建立方法的准确度较好。