细胞移植治疗脊髓损伤性疾病因为其独特的生物学特性以及在脊髓损伤动物模型中明确地促进再生的作用引起了医学界广泛的关注。本研究通过模拟体内神经分化的过程,将体内神经分化特定的因子用于体外胚胎干细胞的神经分化过程中,探讨不同因子在不同诱导时间、空间对脊髓分化的作用,初步诱导获得脊髓特定类型的细胞,为今后的移植治疗提供种子细胞。 本文分析了Racl在胚胎干细胞中的作用,发现Racl活化后能调节改变胚胎干细胞的细胞骨架,并能活化Erk信号途径。其次,通过脂质体和电穿孔方法将GFP转染ES细胞,比较了转染效率,结果发现瞬时表达过程,两种方法转染效率无差别,然而电穿孔方法有利于获得稳定转染细胞克隆。我们利用电穿孔得到的ES细胞进行G418筛选,获得GFP-ES细胞克隆,并用单层分化法诱导其分化为Tuj1阳性的神经细胞。同时,比较了聚集分化中细胞外基质对神经分化的影响,结果显示细胞外基质的程序性应用能有效促进神经分化。最后,研究了RA、Noggin、Bmp4、Bmp7和Shh等因子对胚胎干细胞向脊髓分化中的调节,通过RT-PCR方法检测了这些因子对胚胎干细胞向神经前体分化和头尾轴、背腹轴的模式分化基因表达的影响,并检测脊髓神经元特定类型标记,确定分化效率,结果显示,Noggin对神经分化早期没有作用,但Noggin影响神经模式分化,促进Shh诱导的腹侧分化。RA诱导ES细胞的胚层分化,RA的浓度梯度影响神经前体细胞的头尾轴分化。低浓度RA促进了中脑、后脑基因的表达,高浓度RA促进了后脑、脊髓神经发生。我们利用RA启动ES细胞向神经前体分化后,在早期加入Bmp4可抑制神经分化,而后期加入Bmp4能够调节神经前体细胞的背腹轴分化,而高浓度8mp4诱导Mathl表达,Math1阳性细胞发育成dI1神经元,低浓度Bmp4诱导背侧Mash1表达,发育成dI3神经元。Mashl高表达的神经前体细胞GABA表达阳性。Shh不仅能促进腹侧发育,而且它的浓度梯度将特化不同类型的腹侧神经元。低浓度Shh促进了腹侧中间神经元分化,高浓度Shh诱导得到大量HB9阳性的运动神经元；Bmp7也参与了腹侧神经分化。Bmp7单独作用不能驱使腹侧分化,但是可以提高Shh诱导的腹侧神经细胞表达增高。在比较了各种因子对神经模式分化的影响后,我们初步摸索得到脊髓神经特异神经元分化的方法。通过高浓度RA作用EBs早期,联合Noggin抑制其它胚层分化,在EBs分化的后期,加入不同浓度的Bmp4诱导不同类型的背侧神经元。得到的背侧神经元大部分为r-氨基丁酸的功能性神经元。相比较,在EBs分化的后期,RA与高浓度Shh的联合作用得到了大量的运动神经元,而且,CHAT阳性的神经元比率较高。