肿瘤微环境是肿瘤细胞在生长过程中，由肿瘤细胞、基质细胞和细胞外基质组成的一个相对稳定的局部微环境，该微环境为肿瘤的生长、发展和转移奠定了物质基础。肿瘤组织贫氧和免疫抑制是肿瘤微环境主要的生物学特征。因此通过改善肿瘤组织贫氧和免疫抑制环境可达到抗肿瘤目的。　　肿瘤组织贫氧是肿瘤微环境基本特征之一，而导致肿瘤组织贫氧的主要原因则是血管异常。肿瘤血管异常不仅表现在血管密度增加，而且表现为其结构和功能的异常。HPRG蛋白是半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族成员之一，其不仅可显著抑制肿瘤血管生成，而且可促进肿瘤血管正常化。但是蛋白类药物系统性给药靶向性差，药物生物利用度低。沙门氏菌VNP20009是一种兼性厌氧的革兰氏阴性菌株，其可携带外源质粒，偏好性地在实体肿瘤组织中复制并表达外源蛋白。此外早期研究显示VNP20009也能显著抑制抑制肿瘤血管新生。因此采用VNP20009介导HPRG蛋白在肿瘤组织表达HPRG蛋白并发挥抗肿瘤作用。　　在论文第一部分，使VNP20009在厌氧启动子NirB的调控下在B16F10肿瘤组织中特异性的高表达外源蛋白HPRG，并分析了VNP-pNHPRG抗肿瘤的效果以及其抗肿瘤的机理。研究结果显示VNP-pNHPRG可在肿瘤组织中高水平聚集并复制，而且可在NirB启动子的控制下在肿瘤组织特异性表达HPRG蛋白，而在其他对照组（VNP和VNP-pN）则未见表达。抗肿瘤疗效研究显示:与PBS，VNP和VNP-pN组比较，VNP-pNHPRG显著抑制了肿瘤组织的生长、延迟了肿瘤倍增时间和提高了荷B16F10小鼠的生存时间。在B16F10转移模型中，与PBS，VNP和VNP-pN组比较，VNP-pNHPRG可显著抑制B16F10肿瘤细胞的肺组织聚集，病理学也显示肿瘤细胞在肺组织内部很少浸润，小鼠存活时间也明显延长。　　研究进一步根据HPRG蛋白的生物活性分析了VNP-pNHPRG抗肿瘤的机制，免疫荧光显示VNP-pNHPRG明显抑制了CD31标记的肿瘤血管的密度和面积，这一结果在双光子荧光显微镜3D重构的模型中进一步得到了验证。除了抑制肿瘤血管形成外，VNP-pNHPRG也显著改善了肿瘤血管的异常形态，双光子荧光显微镜显示VNP-pNHPRG治疗后小鼠肿瘤组织血管紊乱状况明显改善，血管主要以二分支为主，而在PBS和VNP-pN组，血管则杂乱无章，多以三分支或多分支为主。免疫荧光标记血管周细胞标记结果显示:VNP-pNHPRG治疗后小鼠肿瘤血管外周细胞覆盖率显著提高，而在PBS，VNP和VNP-pN组很少甚至观察不到。扫描电镜对血管壁进行超微结构观察显示VNP-pNHPRG处理的小鼠肿瘤组织血管平滑，内皮细胞排列紧密，而PBS，VNP和VNP-pN组内管内壁凸凹不平，内皮细胞排列松散。这一结果显示VNP-pNHPRG可显著抑制肿瘤血管形成，并促进肿瘤血管功能正常化。　　肿瘤血管正常化则可显著改善肿瘤内氧处理能力。免疫荧光和定量分析显示VNP-pNHPRG处理的小鼠肿瘤组织中HIF-1α水平显著下降，而PBS，VNP和VNP-pN组小鼠肿瘤组织中HIF-1α表达水平较高。VEGF和Ang-2是HIF-1α的靶基因。荧光实时定量PCR分析显示VNP-pNHPRG处理的小鼠肿瘤组织中VEGF和Ang-2表达水平较PBS，VNP和VNP-pN组明显下调。　　综上所示，VNP-pNHPRG主要通过抑制肿瘤血管形成，调控肿瘤血管的正常化，进而改善肿瘤内贫氧环境，达到抑制肿瘤的目的。　　肿瘤内免疫抑制是肿瘤免疫微环境又一特征，有效的逆转和改善肿瘤内免疫抑制环境可提高瘤内免疫细胞对肿瘤组织的杀伤作用。在论文第二部分，试图通过改善肿瘤内免疫抑制微环境进而达到抗肿瘤作用。STAT6不仅介导机体免疫，而且在细胞增殖、凋亡和肿瘤发生中发挥着重要作用。发现4T1乳腺癌组织中STAT6的表达水平高出正常乳腺组织7倍。为了验证STAT6可能参与了4T1乳腺癌细胞的增殖和迁移，实验采用RNA干扰技术沉默了4T1细胞中STAT6蛋白的表达，结果发现，STAT6蛋白沉默的4T1细胞的增殖和迁移能力较对照组明显下降，提示STAT6可能在4T1乳腺癌肿瘤的发生、发展和转移中发挥着重要作用。因此有效沉默4T1肿瘤细胞中STAT6蛋白的表达可能抑制肿瘤的生长和转移。　　沙门氏菌可携带外源干扰质粒，且可在肿瘤组织靶向富集并侵染肿瘤细胞，但是VNP20009菌株被细胞吞噬后可被囊泡包裹，无法有效释放干扰质粒，进而达不到干扰目的蛋白的效果。因此，为了使沙门氏菌携带STAT6干扰质粒有效沉默STAT6蛋白的表达，本研究在VNP20009遗传背景基础上采用基因重组技术敲除了与细菌胞内存活相关的基因PhoP和PhoQ，命名为VNP(PhoP/Q-)，旨在使其能够有效侵染细胞并在胞内释放干扰质粒，达到沉默STAT6蛋白表达的目的。　　首先，本研究分析了VNP(PhoP/Q-)菌株的生物学功能，高内涵显微镜实时成像、菌落计数和免疫荧光显示VNP(PhoP/Q-)细菌在胞内存活能力明显下降，并在侵染肿瘤组织细胞后将干扰质粒释放于胞质中表达报告基因EGFP，而VNP20009携带的干扰质粒在肿瘤组织中很少释放，几乎观察不到EGFP，说明VNP(PhoP/Q-)可作为干扰质粒的传递载体。　　然后，本研究分析了VNP(PhoP/Q-)携带STAT6干扰质粒对4T1小鼠乳腺癌肿瘤的治疗效果。研究结果显示:与PBS和VpSi-Vector组比较，采用VpSi-STAT6治疗后明显缩小了4T1肿瘤体积，延长了肿瘤倍增时间，提高了小鼠生存率，抑制了肿瘤肺转移的发生。这一结果说明VpSi-STAT6对4T1乳腺癌肿瘤具有很好的治疗效果。　　此外，体外和体内研究显示:VpSi-STAT6可诱导4T1肿瘤细胞和肿瘤组织释放大量的CCL5。而CCL5是主要的单核/巨噬细胞趋化因子，其高水平的表达可趋化大量单核/巨噬细胞向肿瘤组织浸润。本研究显示:VpSi-STAT6治疗后小鼠组织中CD4+、CD8+T淋巴细胞、NK细胞、成熟DC细胞和巨噬细胞比例较PBS和VpSi-Vector组明显增加，提示上述细胞可能参与了VpSi-STAT6介导的抗肿瘤效应。　　为了验证CD4+T淋巴细胞在VpSi-STAT6介导的抗肿瘤中的作用，体外实验将VNP(PhoP/Q-)感染4h的4T1sTAT6+或4T1STAT6-细胞和T淋巴细胞共培养，分别采用实时荧光定量PCR分析了4T1乳腺癌细胞TH1和TH2类细胞因子和趋化因子以及T淋巴细胞TH1和TH2类细胞因子和转录因子的表达情况。结果显示:与4T1STAT6+细胞比较，4T1STAT6-细胞经VNP(PhoP/Q-)感染后TH1类细胞因子IL-12和IFN-γ的水平显著上调，而TH2类细胞因子IL-13和IL-10的水平显著下调，IL-4未检测到。与4T1STAT6+细胞共培养的T淋巴细胞比较，与4T1sTAT6-细胞共培养的T淋巴细胞TH1类细胞因子IL-12和IFN-γ的水平显著上调，而TH2类细胞因子IL-13、IL-4和IL-10的水平未改变，同时与TH1细胞激活相关的转录因子JAK1和T-bet表达水平也显著上调。在体内动物水平上，将肿瘤组织匀浆后测定瘤内TH1类和TH2类细胞因子水平显示:经VpSi-STAT6治疗的小鼠肿瘤组织中TH1类细胞因子IL-12和IFN-γ的水平较VpSi-Vector治疗的小鼠显著上调，而TH2类细胞因子除IL-4未变化外，IL-13和IL-10的水平显著下调。结果与体外实验一致。说明VpSi-STAT6提高了IL-12和IFN-γ表达水平，进而通过旁分泌机制作用于TH1细胞，激活TH1类细胞因子的转录表达。而TH1类细胞因子的高水平表达对肿瘤细胞具有大量杀伤作用，这可能是VpSi-STAT6具有抗肿瘤效果的原因之一。　　巨噬细胞具有很强的异质性，在不同细胞因子的刺激下可发生表型逆转。本研究显示VpSi-STAT6治疗小鼠后4T1乳腺癌肿瘤组织中肿瘤巨噬细胞的表型由M2型转化为M1型，这一结果与VNP(PhoP/Q-)体外刺激STAT6沉默的M2型RAW264.7细胞系的表型转化一致。说明VpSi-STAT6治疗后肿瘤内TH1类细胞因子促进了其表型转化，这也是VpSi-STAT6具有较好抗肿瘤效果的原因之一。此外，VpSi-STAT6促进了DC细胞的激活，使其可呈递抗原，并与大量浸润的CD8细胞作用介导细胞毒效应。而大量浸润的NK细胞作为先天性杀伤细胞，可直接杀伤肿瘤。　　综上所述，VpSi-STAT6抑制4T1乳腺癌肿瘤生长和转移，一方面是STAT6沉默抑制了细胞增殖和迁移，另一方面是其改善了肿瘤免疫微环境，增加了瘤内抗肿瘤免疫反应。本研究所构建的VpSi-STAT6为乳腺癌治疗提供了新的思路和依据。