辣椒疫霉效应分子Crinkler的表达、纯化与结晶研究

来源 :山东农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:misswj2009
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辣椒疫霉(Phytophthora capsici Leonian)是一种世界性广泛发生的土传兼性寄生菌,侵染寄主广泛,包括辣椒、番茄、茄子、瓜类等多种茄科及葫芦科植物。辣椒疫霉可侵染植物的多个器官,且发病严重,发病期长。1922年,Leon Leonian最早记载了发生在墨西哥的辣椒疫病,确定其病原为Phytophthora capsici。辣椒疫病的发生严重影响了辣椒的产量和品质,造成了巨大的经济损失,同时也对环境产生了一定影响。在植物与病原微生物漫长的共进化过程中,已经形成了有效地生存系统来识别特殊的效应分子,并且诱导防卫反应。这种寄主反应就称之为效应分子触发的免疫反应。皱缩坏死蛋白(CRN)就是效应分子的一种——胞质效应分子。在病原菌与寄主互作过程中它们通过附着胞或吸器等侵染结构进入寄主细胞,调节植物的防卫反应。在本研究中,成功克隆了多个CRN效应分子基因,并进行了原核表达试验以期获得高纯度(>95%)、高浓度(>10mg/mL)蛋白用以进行蛋白晶体的生长。通过高质量蛋白晶体的X射线衍射,解析CRN效应分子的结构,从分子水平阐释其可能参与到的致病机制、多寄主机制、转运机制以及与寄主的共进化机制。主要结果如下:(1)从辣椒疫霉基因组中筛选并克隆到了5个相关的CRN效应分子基因,其氨基酸序列与原序列比对同源性较高,虽有所差异,但保守序列及其位置没有变化,此差异可能是由不同菌株或不同交配型造成的。(2)PC080完全符合CRN效应分子家族的一些特征:N端保守,有一段寄主靶标信号;C端为其效应区但不保守。功能域预测发现其C端有酪氨酸激酶活性,暗示其可能参与胞内的信号传导。柔性区、二级结构的预测和三级结构建模等信息为后续的蛋白表达纯化结晶提供了指导。(3)针对CRN蛋白的特点及生物信息学分析,在全长蛋白无法获得可溶性表达的条件下,我们设计了截短体表达。考虑的标准包括以下几点:①尽量避免破坏预测的二级结构元素,尤其是β-折叠,如果遇到一个长α-螺旋,有些情况下可以考虑从中间切开;②尽量保持蛋白功能域的完整性;③尽可能较少的保留其无序的柔性区,以有利于后续的结晶;④切除信号肽,尽量避免在末端出现疏水性残基。(4)通过截短体设计,基因两端加双His标签,亲和层析洗杂过程中加尿素、Tween-20,提高洗杂时咪唑的浓度,又经过离子交换层析与凝胶过滤层析纯化,最终我们得到了高纯度的目的蛋白。(5)PC080截短体晶体的生长主要瓶颈在于难以获得稳定性高及性状好的蛋白溶液,由于该蛋白在结晶过程中无定形沉淀的生长速度远大于晶体的生长速度。经过各种手段纯化出的蛋白尝试晶体生长,最终长出以上报道的晶体。在表达过程中用到的载体有pET28a、pET28a-SUMO、pMal、pGOOD6p-1(GST)等,用以尝试筛选高效可溶表达的重组菌株;在纯化过程中应用的纯化方法有亲和层析(6×His标签)、离子交换层析、凝胶过滤层析。
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