广州地区犬、猫细小病毒的分离鉴定、遗传进化分析及TaqMan探针荧光定量方法的建立

来源 :华南农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:thp2860051
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猫泛白细胞减少症病毒(Feline panleukopenia virus,FPV)又称猫细小病毒,自二十世纪初在猫体内被分离,可导致严重的白细胞数目减少、胃肠炎和神经症状。犬细小病毒(Canine parvovirus 2,CPV-2)在20世纪70年代后期作为犬科病原体出现,可以引起出血性肠炎和幼龄犬心肌炎。在20世纪80年代,出现了两种抗原亚型(CPV-2a和CPV-2b),最终完全取代了原来的CPV-2,2000年在意大利报道了新的变异株CPV-2c。目前猫泛白细胞减少症病毒、犬细小病毒及其亚型在全球范围内分布广泛,具有高致病性及高死亡率,给世界范围内的犬、猫种群造成严重的威胁。犬、猫细小病毒的衣壳蛋白VP2的基因突变已被证明会影响不同抗原变体的进化(Decaro et al.,2007;Pinto et al.,2012),病毒VP2基因的序列分析及其后续表征对于研究病毒的系统发育具有非常重要的作用。本研究在2016年至2018年从广州地区的各个动物医院采集具有细小病毒发病症状的犬、猫粪便及肛门拭子,并将这些病料接种F81细胞系进行病毒分离。获得8个毒株包括6株犬细小病毒和2株猫细小病毒,通过扩增VP2基因序列并测序,分析并绘制相应的系统进化树,结果显示6株犬细小病毒均处于东南亚地区的分枝上,其中有2株是New-CPV-2a(297、440处氨基酸残基均为丙氨酸),4株是CPV-2c(426处氨基酸残基均谷氨酸)。New-CPV-2a的两株分离株显示他们分别来自不同的祖先,而CPV-2c分离株则共同构成一个分支,并且系统发育分析显示CPV-2c分离株均与2014年中国山东的CPV-SD/14/12分离株同源性最高。从时间上分析2016-2018年间广州地区的CPV流行株主要为New-CPV-2a及CPV-2c。FPV进化树分析结果显示这两个分离株与多个中国的分离株处于同一分支,表明本次分离到的毒株在地理位置上流行性还是在中国范围内,而2017年的分离株FPV-LM在VP2衣壳蛋白氨基酸残基上第16、67、75处中出现了3个之前没有发生的突变。这些突变位点是否稳定出现在其他毒株,尚需更广泛的序列测定及分析。本文在分离病毒的基础上建立了一种针对犬、猫细小病毒的TaqMan探针荧光定量方法。事实证明该方法具较高灵敏度,能够检测到82.3个拷贝/μL的病毒DNA,高于常规PCR检测。该实时荧光定量PCR方法展示出了对犬科和猫科细小病毒病诊断出色的适用性,为犬、猫细小病毒病的临床诊疗提供可靠手段。
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