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目的:多维度探讨血标本来源的多重耐药革兰阴性菌耐药性变化及广东地区的鲍曼不动杆菌的流行株毒力研究. 方法:本研究主要分为两部分:(1)收集我国7个地区2013年和2015年血标本来源的非重复分离菌264,151株,分析碳青霉烯耐药的大肠埃希菌(carbapenem-resistantEscherichia coli,CREC)、肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiella pneumoniae,CRKP)和广泛耐药的铜绿假单胞菌(extensively drug-resistantPseudomonas aeruginosa,XDRPA)、鲍曼不动杆菌(extensively drug-resistantA.baumannii,XDRAB)在地区(东北、华北、华东、华南、华中、西北和西南地区)、医院(三级和二级医院)、不同年龄组[老年组(>65岁)、成人组(15~65岁)、儿童组(29天至14岁)和新生儿组(≤28天)]及所住病房(呼吸重症监护和普通呼吸病房)的分布变化.(2)收集我国广东地区5所三级医院重症监护病房(intensive care unit,ICU)中医院获得性肺炎(hospital-acquired pneumonia,HAP)/呼吸机相关性肺炎(ventilator-associated pneumonia,VAP)患者的痰和/或血中分离的168株鲍曼不动杆菌,分析其分子流行病学、临床特征和基因特征,同时使用血清实验、蜡螟模型和小鼠模型对其毒力进行分析. 结果:(1)各目标多重耐药菌的全国平均分离率显示,在2013年至2015年间,CREC(分别为1%和1.5%)和XDRPA(分别为4.2%和3.2%)的分离率保持在低水平;CRKP(5.5%vs9.4%)分离率稍有升高(P均<0.01).而XDRAB全国平均分离率升高明显,从13.7%(256/1,862)增长到21.5%(1,201/5,576)(P<0.001);除西北地区外,其他六个地区XDRAB分离率均呈现不同程度的增长,其中华南地区增长幅度最大,从2013年的5.8%(13/224)增长至2015年的22.1%(219/994).在不同病房的流行情况方面,ICU中CREC,CRKP、XDRAB和XDRPA的平均分离率(2.6%、22.3%、27.6%和5.3%)均高于其在非ICU病房的分离率(1.3%、5.9%、13.6%和3.0%)(P均<0.001).人群分布方面,在三年间,儿童组CREC的分离率显著上升(1.5%vs3.4%),其中2015年儿童组的CREC分离率(3.4%,73/2,126)分别高于老年组(1.3%,265/20,096)和成人组(1.5%,353/23,433)(P均<0.01);新生儿组(13.7%,171/1,1252)和儿童组(14.6%,244/1,669)CRKP的总体分离率均分别高于成人组(6.9%,867/12,491)和老年组(8.7%,793/9,114),其中新生儿组(10.6%vs15.4%)和儿童组(10.7%vs16.1%)的分离率显著升高(P均<0.05);成人组(20.4%,812/3,985)和老年组(21.1%,586/2,776)XDRAB的总体分离率均分别高于儿童组(9.5%,51/538)和新生儿组(6.2%,8/130),其中老年组(15.4%vs22.8%)和成人组(12.9%and23.1%)XDRAB的分离率显著上升(P<0.05). (2)从HAP/VAP病人共收集168株非重复分离的鲍曼不动杆菌,其中83株分离自血培养和下呼吸道痰标本共同阳性的病人(取血液来源株),85株分离自下呼吸道痰培养阳性且血培养阴性的患者(取下呼吸道分离株)(92.3%(155/168)的菌株对碳青霉烯类耐药).选取其中158株CC92克隆株分为三个组别[分别为ST457组,ST195/208组(代表目前中国最流行的克隆株)和其他CC92克隆株组]进行临床资料分析,结果显示ST457组的7天死亡率和7天死亡占比均较其他CC92克隆株组高(44.4%vs14.3%,P=0.014;70.6%vs26.7%,P=0.013);培养阳性后的死亡时间ST457较其他CC92克隆株短(8.71±15.27vs25.20±6.51,P=0.024).MLST结果显示,168株鲍曼不动杆菌共鉴定出16个ST型,其中10个ST型属于CC92克隆株[ST195,ST208,ST369,ST381,ST457,ST540,ST136,ST548,STn1(1-15-3-2-2-96-3):ST195和ST457的一个单位点突变体(SLV)和STn2(1-15-3-2-2-97-3)],占所有菌株的94.0%(158).其数量最多的ST型为ST195,占比达41.7%(70/168);其次为ST457,占比为19.6%(33/168),为广东地区新出现的优势克隆株.全基因测序分析显示,ST457与其他CC92克隆株有1500-1800SNPs的差异,主要分布在起始区域(1-223774)和末端区域(3662555-3846621),且ST457的这两个区域与ST758和高毒力株LAC-10(ST10)有高度相似性,提示ST457与其他CC92克隆株发生了多个重组事件.而这些重组区域包含了一个371个基因编码的荚膜基因(KL),该基因涉及了其多个代谢途径和生物学过程.耐药基因分析显示ST457携带了8-12个耐药基因,包括常见的blaOXA-23,与ST195和STn1相似,但较其他非CC92克隆株携带的耐药基因多.ST457、ST195、ST136和STn1的blaOXA-23基因位于转座子Tn2006上,其余CC92克隆株的blaOXA-23基因位于转座子Tn2009上.其中ST457,ST195(AB3and AB9),and ST136(AB1)的基因上发现一个与AbaR-25相似的耐药岛(命名为AbaR-25a)携带有两个Tn2006转座子.毒力基因分析显示,除外1株ST457(AB31)外,95.5%(21/22)的ST457携带CsuA/BABCDE;所有的测序的ST457均携带与高毒力株LAC-4相同荚膜型基因(KL49);另外与non-CC92菌株相比,ST457携带更多的毒力基因,包括铁载体基因siderophore(acinetobactin基因簇bas-bau-bar)、肠菌素合成酶entE基因、生物膜合成相关基因bap和参与血红素利用的多个毒力基因.选取12株[3株ST457,3株ST195,3株ST208,3株非流行克隆株株(2株non-CC92,1株ST136)]临床分离的鲍曼不动杆菌进行血清实验和蜡螟实验,结果显示75%(9/12)的菌株对人血清保持较高的耐血清性,其耐血清菌株在血清的存活率为74.7~119.8%.蜡螟实验结果显示,与其他CC92克隆株和non-CC92克隆株相比,ST457感染后的蜡螟54小时生存率较低,除外一株缺乏CsuA/BABCD菌毛伴侣蛋白的ST457(AB31)感染蜡螟后的54小时生存率相对较高外(64.0%),其余两株ST457(AB18和AB24)感染蜡螟后,其生存率分别为16.7%(54小时)和0%(24小时);其余ST195、208和non-CC92菌株感染蜡螟后,其54小时生存率分别为56.7~76.7%、30~80%和60.0~86.7%.选取蜡螟实验生存率最低的ST457(AB24)、ST195(AB8)、ST208(122560)各一株和强毒力国际标准株AB5075对比,进行小鼠肺炎模型实验,结果显示高毒力株AB5075感染组小鼠7天生存率为0%;ST457和ST208感染组小鼠感染后第42小时开始出现死亡,其7天生存率为42.9%;而ST195感染组小鼠第72小时开始出现小鼠死亡,其7天生存率为85.7%. 结论:(1)我国CREC、CRKP和XDRAB分离率呈逐步上升的趋势,其中华南地区XDRAB上升幅度尤为突出.同时鉴于儿童群体(CREC、CRKP的高分离率)和老年、成年人群体中(XDRAB的高分离率)耐药菌的分布特点,建立地区或人群的耐药菌分子流行病学监测体系有助于更好地控制或缓解其细菌耐药性. (2)ST457是我国广东地区新出现的流行克隆株,其长期进化获得的血清抗性表型,以及获得性的耐药基因和毒力基因都促进了该流行株的传播和致病性.而其毒力的增加也提示了主动监测其流行病发展和预防其临床感染的必要性.