香菇(Lentinusedodes),因其味道鲜美、营养丰富,自古以来就是人们餐桌上的佳品,同时其具有“益气不饥、治风破血和益胃助食”的功效。香菇多糖是香菇子实体中最有效的生物活性成分,在20世纪70年代,有研究人员首次发现了一种具有一定的抗肿瘤活性的天然植物多糖,即香菇多糖。这使得香菇多糖的抗肿瘤活性立即成为天然产物及保健品的研究热点。目前研究发现,香菇多糖具有调节血脂、抗肿瘤、改善免疫力、抗氧化等多种药理作用。现香菇多糖已有多个品种上市,但是其抗肿瘤作用机制尚不明确,目前学者普遍认为香菇多糖的抗肿瘤作用是通过增强机体免疫功能来发挥的。因此香菇多糖在临床上多作为免疫调节剂参与肿瘤的辅助治疗。本课题组前期研究发现,香菇多糖在调节机体免疫力的同时,还能诱导肿瘤细胞凋亡,发挥直接抗肿瘤作用。因此,把香菇多糖与抗肿瘤化疗药物联合使用,探讨其与化疗药物的联合作用及机制,充分发掘香菇多糖的药用价值,对香菇多糖的临床应用及肿瘤的临床治疗具有重要意义。本论文拟从房县小花菇子实体中分离纯化得到精制香菇多糖组分JLNT,将其与传统抗肿瘤化疗药物奥沙利铂及异环磷酰胺分别联合使用,探索其对肝癌及淋巴癌的联合用药效果,并明确其可能的作用机理,为拓宽香菇多糖在临床上的适应证及应用提供理论和实验基础。第一部分香菇多糖JLNT的制备以房县小花菇为原料,采用稀碱液提取法提取得到香菇粗多糖,经过氧化氢除蛋白及色素、500kDa的超滤膜分级分离、冷冻干燥得到精制香菇多糖组分JLNT。糖含量检测采用苯酚-硫酸法进行,结果约为97%;紫外(UV)扫描结果表明精制香菇多糖中几乎不含核酸和蛋白质;高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)检测其相对分子量为550 kDa,且分子量均一以上结果表明,本方法制备的香菇多糖性状良好,满足后续实验需求。第二部分香菇多糖联合奥沙利铂体外抗肝癌的协同增效作用及机制研究以MTT比色法考察香菇多糖和奥沙利铂对人肝癌细胞HepG2和小鼠肝癌细胞H22体外增殖的抑制作用。结果表明,香菇多糖及奥沙利铂对HepG2及H22细胞的体外增殖均有抑制作用,且呈剂量依赖性。两种药物联合使用后,对肿瘤细胞增殖的抑制作用均显著增加。采用Chou-Talalay联合用药指数法计算香菇多糖与奥沙利铂的联合用药指数。结果表明,香菇多糖与奥沙利铂联合使用对HepG2细胞发挥协同增效作用,对H22细胞除最低浓度外亦发挥协同增效作用。应用流式细胞仪检测HepG2凋亡细胞,发现香菇多糖(8000μg/mL)、奥沙利铂(20μM)和联合给药(800μg/mL+20μM)的凋亡率分别为16.24%、20.01%和30.60%。结果表明,香菇多糖及奥沙利铂抑制肿瘤细胞增殖的机制可能与诱导肿瘤细胞凋亡有关。采用蛋白质免疫印迹法(Westernblot)检测HepG2细胞中凋亡相关蛋白caspase-3、NF-κB及survivin蛋白的表达来研究香菇多糖及奥沙利铂诱导HepG2细胞凋亡的分子机制。结果显示,香菇多糖与奥沙利铂联合使用后,Caspase-3和cleavedcaspase-3的表达均显著提高,而survivin的表达则显著降低。奥沙利铂能够上调NF-κB的表达,提高细胞对凋亡的抵抗性,而联合给药能够降低NF-κB的表达。采用细胞转染survivin过表达质粒法进一步确认survivin在香菇多糖与奥沙利铂联合使用中的作用。结果表明,转染survivin过表达质粒后,联合给药对Caspase-3及Cleaved caspase-3的表达无明显影响,表明survivin可能是香菇多糖联合奥沙利铂诱导HepG2细胞凋亡的靶点之一。第三部分香菇多糖联合奥沙利铂抑制H22荷瘤小鼠肿瘤生长的作用及机制研究采用H22荷瘤小鼠模型考察香菇多糖及奥沙利铂的体内抗肿瘤活性及作用机制。实验分为阴性组(腹腔注射葡萄糖溶液)、香菇多糖组(腹腔注射香菇多糖25 mg/kg)、奥沙利铂组(腹腔注射奥沙利铂10mg/kg)和联合给药组(腹腔注射香菇多糖和奥沙利铂25 mg/kg+1 mg/kg)。实验结果显示,香菇多糖、奥沙利铂和联合给药对H22实体瘤的抑瘤率分别为31.24%、59.09%和80.98%,抑瘤效果显著。采用免疫组化法及Elisa法检测H22肿瘤组织中CD31及VEGF的表达,考察香菇多糖及奥沙利铂对H22荷瘤小鼠肿瘤血管生成的影响。实验结果表明,联合给药后,CD31及VEGF的表达均明显减少,显示香菇多糖和奥沙利铂能够通过降低VEGF的表达来发挥抑制肿瘤血管生成的作用。采用H&E染色及Tunel染色法考察H22肿瘤组织中细胞凋亡情况。结果显示,香菇多糖及奥沙利铂均能诱导H22肿瘤细胞凋亡,而联合给药能够增强其诱导凋亡的作用。肿瘤组织凋亡相关蛋白通过Western blot法检测,结果显示,联合给药后,具有促进凋亡作用的关键蛋白Bax的水平显著上调,而具有抑制凋亡作用的关键蛋白Bcl-2的水平明显下降,Bax/Bcl-2的值显著升高,cleavedcaspase-8的表达显著提高,survivin 的表达下降,caspase-3 及 cleavedcaspase-3 的表达提高,NF-κB、STAT3 及 p-STAT3的表达降低。结合体外与体内实验,初步得出香菇多糖联合奥沙利铂诱导肿瘤细胞凋亡的主要途径有:(1)下调STAT3和p-STAT3的表达,直接或间接的抑制survivin的表达,从而激活caspase-3,促进肿瘤细胞凋亡;(2)上调Bax的表达,下调Bcl-2表达,从而提高Bax/Bcl-2的比值,启动线粒体凋亡程序,最终促进caspase-3的表达,促进肿瘤细胞凋亡;(3)下调NF-κB的表达 直接或间接的促进caspase-8的激活,启动caspase级联反应,促进caspase-3的表达,最终促进肿瘤细胞凋亡。第四部分香菇多糖对奥沙利铂不良反应的影响记录H22荷瘤小鼠给药期间的体重变化,考察奥沙利铂对小鼠体重的影响。实验结果显示,给予奥沙利铂后,小鼠体重显著降低,而给予香菇多糖2周后能够有效缓解奥沙利铂引起的体重下降。记录H22荷瘤小鼠给药期间的腹泻情况,并应用H&E染色考察香菇多糖和奥沙利铂对小鼠小肠及肝脏的影响。实验结果显示,奥沙利铂给药后小鼠出现较严重的腹泻,而香菇多糖能够缓解奥沙利铂引起腹泻的发生率及程度,这可能与香菇多糖保护奥沙利铂引起的小肠损伤有关。肝脏H&E染色表明,奥沙利铂使小鼠肝脏出现空泡,肝细胞间隙变大,引起肝损伤,而香菇多糖能够有效缓解奥沙利铂的肝毒性。利用脾指数、碳粒廓清实验及流式细胞仪考察奥沙利铂对小鼠免疫力的影响。实验结果表明,奥沙利铂能够显著降低小鼠脾指数,而香菇多糖能够有效缓解奥沙利铂的细胞毒作用,提高小鼠脾指数。奥沙利铂亦能够显著降低小鼠的吞噬系数,降低小鼠巨噬细胞的吞噬能力。联合给药后,吞噬系数有一定提高,巨噬细胞的吞噬能力得到恢复。奥沙利铂降低CD4淋巴细胞及CD8淋巴细胞数,但CD4/CD8的比值有所上升。联合给药后,CD4及CD8淋巴细胞数有所上升,CD4/CD8的比值亦上升,但无统计学差异。第五部分香菇多糖联合异环磷酰胺抗小鼠淋巴瘤的协同增效作用研究体外采用MTT法考察香菇多糖JLNT对人淋巴瘤细胞Raji、小鼠淋巴瘤细胞EL4体外增殖的抑制作用。结果表明,香菇多糖对EL4细胞具有直接抑制作用,且呈剂量依赖关系,但对Raji细胞增殖无明显抑制作用。体内建立EL4荷瘤小鼠模型考察香菇多糖联合异环磷酰胺对小鼠实体瘤生长的抑制作用。实验结果显示,香菇多糖及异环磷酰胺对EL4荷瘤小鼠肿瘤生长均有一定抑制作用,但由于个体差异较大且小鼠成瘤率较低,量效关系不明显,因此不能判断香菇多糖与异环磷酰胺联合使用发挥何种效应。