研究背景：　　由于人们在20世纪80年代之前尚没有认识到戊型肝炎病毒（hepatitis E virus,HEV）的存在，故HEV被众多学者称为“被遗忘的病毒”。直到上世纪80年代，在苏联占领的阿富汗军营中爆发了一种不明原因的肝炎，后来研究人员利用电镜在志愿者的大便中发现了病毒颗粒，经基因测序，于1991年正式命名为HEV。近年来，随着医学检测手段的不断提高以及人们对其认识的不断深入，HEV所引起的公共卫生问题也逐渐成为科学界关注的焦点。先前认为，HEV感染主要发生于基础卫生设施条件较差的发展中国家，但近年来，在欧美、日本等一些发达国家也出现了一些非输入性本土化的HEV感染病例。目前，HEV感染呈全球分布，全世界每年约20亿人感染HEV，约1400万人为有症状者，每年约30万人死于HEV感染，HEV感染占急性肝炎的50％以上，已成为全球急性病毒性肝炎的首要病因。自2012年开始至今，HEV在我国的感染及死亡总人数每年均超过甲型肝炎病毒（hepatitis A virus,HAV）。传统观念认为，HEV感染后为一自限性过程，但在普通人群中仍有1-2%的患者发展为重型肝炎而导致死亡，孕妇感染HEV后可导致高达26.9%的死亡率，近年来在器官移植、肿瘤放化疗及HIV感染者等一些免疫功能受到抑制的人群中出现了为数不少的慢性化病例的报道。因此，戊肝的防控形势不容乐观。尽管我国在2012年上市了全球第一支HEV疫苗，但HEV致病的确切机制并未得以详细的阐明。　　HEV是一单股正链RNA病毒，全长约7.2kb，有3个开放读码框（ORF），4个基因型，1个血清型。其中，基因I型和II型主要感染人类，而III型和IV型为人畜共患性疾病；我国主要流行基因I型和IV型。研究发现，基因I型HEV感染后相较其它基因型HEV感染具有更高的病毒血症和更严重的病情，但机制不明。由于缺乏成熟的小动物研究模型和体外细胞模型，目前对HEV致病机制的研究大多集中于对其基因组功能的分析上。HEV的ORF1和ORF2分别编码HEV的非结构蛋白和衣壳蛋白，ORF3片段具体的功能目前尚没有一致意见。　　本课题组前期研究发现，HEV ORF3蛋白抑制TNF-α诱导的p65入核，我们推测，ORF3蛋白可能通过调控宿主细胞核因子-κB（nuclear factor-κappa B，NF-κB）信号为HEV复制优化环境。本研究通过构建HEV ORF3蛋白的真核表达质粒，以人肺腺癌A549上皮细胞（A549）为载体，检测HEV ORF3对细胞NF-κB信号的影响,从细胞水平进一步探讨HEV ORF3蛋白在TNF-α诱导的NF-κB信号调节中的具体作用及机制，初步揭示HEV感染后细胞内信号异常与HEV致病的相关性，为阐明HEV的致病机制奠定理论基础。　　研究目的：　　在前期研究工作基础上，进一步探讨基因I型戊型肝炎病毒ORF3蛋白在TNF-α诱导的NF-κB信号转导中的作用及调控机制，阐明基因I型HEV导致较高病毒血症及较严重病程的具体机制。　　实验方法　　1.根据已经报道的巴基斯坦株Sar-55（基因I型HEV）的cDNA序列中ORF3片段的序列，分别设计其上下游引物，采用PCR方法扩增出HEV ORF3片段，利用限制性内切酶将ORF3片段连接在真核表达载体pEGFP-N1上，构建带有绿色荧光的ORF3真核表达质粒（ORF3-GFP），基因测序及酶切鉴定正确；　　2.将鉴定正确的ORF3-GFP融合蛋白瞬时转染A549细胞，48小时后，以TNF-α（50ng/ml）诱导NF-κB信号活化，通过蛋白印迹技术（Western blot）分别检测细胞浆和细胞核内p65的表达水平，通过凝胶电泳迁移实验（EMSA）检测NF-κB的DNA结合活性，分别以实时荧光定量PCR（real time PCR）和酶联免疫技术（ELISA）检测NF-κB下游分子的变化情况；　　3.用Western blot检测NF-κB经典信号通路途径中IKKβ的活性变化及IKBα的磷酸化水平的变化；以基因芯片技术（PCR Array）初步筛选ORF3-GFP作用于NF-κB信号通路中的关键分子，并以real time PCR和Western blot技术分别从mRNA水平和蛋白水平进行验证；　　4.设计并合成上述PCR Array中发现的负性调控基因的三条特异的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA），进行干扰效果的初步评估，采用RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术干扰上述初筛的主要调控基因后，以荧光素酶报告基因活性检测TNF-α诱导的NF-κB活性的变化；　　5.通过Western blot检测内质网应激和非折叠蛋白反应的标志蛋白，观察A20分子表达与内质网应激的相关性；给予非折叠蛋白反应的阻滞剂对细胞进行预处理，然后转染ORF3-GFP，给予TNF-α干预，以荧光素酶报告基因活性检测NF-κB活性。　　实验结果　　1.成功构建了基因I型HEV ORF3表达载体，将其转染A549细胞，48小时后，荧光显微镜下可以看到绿色荧光表达，以HEV ORF3单克隆抗体行Western blot检测，验证了ORF3蛋白在A549细胞中成功表达，将构建的质粒经基因测序及酶切鉴定正确；　　2.Western blot显示，在没有TNF-α刺激时，p65主要位于细胞浆内，给予TNF-α刺激后，空白组及转染空载体的A549细胞，p65出现了明显的核转移，而转染了ORF3-GFP蛋白的细胞，给予TNF-α刺激后，细胞核内p65的数量极少；　　3.EMSA实验表明，转染GFP的细胞和未处理的细胞给予TNF-α刺激后，与阳性对照组一样，出现了蛋白-DNA复合物，而表达ORF3-GFP蛋白的细胞组即使给予TNF-α刺激，也未见蛋白-DNA复合物的出现，蛋白-DNA复合物在冷竞争实验时消失，而进行突变竞争实验时，该复合物再次出现；　　4.Real time PCR示ORF3-GFP明显抑制了TNF-α诱导的NF-κB的下游基因IL-1β、COX2和ICAM1的mRNA表达水平;ELISA证实NF-κB的下游分子IL-1β、COX2、和ICAM1的蛋白水平也同样受到了抑制；　　5.Western blot显示，空白细胞组和转染空载体的细胞组给予TNF-α刺激后，IKKβ活性和IKBα的磷酸化水平明显增强，而转染ORF3-GFP蛋白的细胞给予TNF-α刺激后，IKKβ活性和IKBα的磷酸化水平明显受到抑制；　　6.PCR Array实验表明，转染ORF3-GFP蛋白的细胞A20基因水平明显高于对照组10倍以上，real time PCR和western blot也证实了同样的结果；　　7.将A20基因进行RNAi后，ORF3-GFP蛋白抑制NF-κB活性的现象得到了逆转；表达ORF3-GFP蛋白的细胞组A20的升高与GRP78呈正相关性，将非折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）抑制后，ORF3-GFP抑制TNF-a诱导的NF-κB活性的现象也得到了逆转。　　结论　　1.基因I型HEV ORF3蛋白抑制TNF-α诱导的NF-κB活性及其下游分子，提示这可能是基因I型HEV在体内持续存在并引起较高病毒血症和更长病程的原因；　　2.基因I型HEV ORF3蛋白在早期可能通过内质网应激和UPR激活NF-κB信号，随后，NF-κB下游的靶基因A20在NF-κB信号中发挥负性调控作用，及时终止NF-κB信号的无限放大。这提示，ORF3蛋白在不同的阶段对NF-κB信号的调控可能存在双向调节作用。　　3.内质网应激与NF-κB信号之间有着密切联系，内质网应激不仅可以激活NF-κB信号，在特定环境下，还可以对NF-κB信号发挥负性调控作用。