绵羊的产羔率是其主要经济性状之一,直接关系到养羊业的经济效益。产羔率受多个主效基因的控制,其中骨形态发生蛋白受体lB(BMPR-1B)发生A746G突变后被称作FecB基因,其增羔效应最显著,而且遗传稳定,有加性效应,一直受到人们的关注。FecB基因主要分布在一些高产的多胎品种中,但有些低产绵羊品种中也有携带FecB基因的少数个体,而且其产羔率显著地高于其它羊只。如果能够筛选出这些特殊的个体,加以精心扩繁培育,对于本品种选育改良以及培育高产的新品系无疑具有非常重要的意义,而目前所报道的绵羊FecB基因检测方法,如果用于大群筛查检测,则费时费工。另外,绵羊FecB基因因其优良的增羔效应已得到广泛的利用,主要方式是通过引入杂交以改良当地低产品种,但当地低产羊固有的一些优良性能随之受到影响。如果通过基因组编辑技术定点突变绵羊的BMPR-1B基因,产生FecB基因,可以在不引入外血的情况下,提高绵羊的繁殖性能,针对性地提高产羔率,但目前这方面的研究很少。[研究目的]:本研究的目的就是建立一种绵羊FecB基因低丰度检测方法,为其大群高通量快速筛查检测提供便利;并通过基因打靶在阿勒泰羊中引入FecB基因,以提高其产羔率,同时为其它低产绵羊提供借鉴意义。[研究方法]:1.绵羊低丰度FecB基因检测方法的建立首先,我们按照低变性温度共扩增PCR(Co-amplification at lower denaturation temperature-PCR,COLD-PCR)和高分辨率溶解曲线分析(High resolution curve analysis,HRM)的实验要求,设计合成绵羊FecB基因检测引物。提取湖羊和阿勒泰羊的基因组,经FecB基因的测序检测后,制备了COLD-PCR的模板标准品。然后,用模板标准品建立了FecB基因的qPCR HRM分型方法,检测了其分型灵敏度;并应用于320只湖羊的FecB分型实验,测序检测其分型准确性,统计产羔率,进行了FecB基因型和产羔率关联分析。最后,经过优化条件,建立低丰度FecB基因的COLD-PCR HRM检测方法,并对方法的可重复性做了验证。2.阿勒泰羊胎儿成纤维细胞BMPR-1B基因A746G突变(以下称之为“FecB突变”)阳性单克隆细胞株的制备本研究设计并委托公司构建了一对TALENs质粒,通过测序和HRM检测其作用活性。设计构建了绵羊BMPR-1B基因打靶载体PMD18-L-loxp-pA-noe-PGK-loxp-RPGK-DTA-pA(命名为K1)和负筛选打靶载体PMD18-L-loxp-pA-R-PGK-DTA-pA(命名为K2),测序验证序列正确性,设计合成单链脱氧寡核苷酸(Single stranded oligodeoxynucleotides,SSO),三者分别作为同源重组的DNA模板。分离培养了阿勒泰羊胎儿成纤维细胞,HRM和测序检测其FecB携带情况,并做了性别检测。分别用三个同源重组的dna模板与talens质粒共转染阿勒泰羊胎儿成纤维细胞;同时用荧光报告载体pegfp-n1代替同源重组的dna模板,做为对照平行实验。细胞转染48小时后,在荧光倒置显微镜高倍视野下肉眼计数细胞,通过分别在白光和紫外光下统计相同视野的细胞总数计算细胞的荧光率,或者通过流式细胞仪检测荧光率以评估转染效率。sso和k2打靶载体转染的细胞传一代,待细胞活力恢复后,通过有限稀释法制备单克隆细胞株;k1打靶载体转染的细胞传一代后,通过g418筛选,制备抗性单克隆,选取活力较好的抗性单克隆进行第二轮g418筛选,得到单克隆细胞株。单克隆细胞株通过测序和检测两同源臂间序列的敲入情况进行突变阳性检测。3.阿勒泰羊fecb突变胚胎和个体的构建采集绵羊卵母细胞,经过检测为fecb突变阳性的单细胞克隆株用作供体,进行核移植,经过电融合、激活和短暂培养后,得到的重构胚胎,部分移植到发情的代孕母羊;另一部分继续培养一周,观察胚胎发育情况,统计囊胚率。同时,以未打靶细胞作为核移植供体,进行同样的操作,重构胚培养1周,作为实验组胚胎发育的对照,检测基因打靶对囊胚发育的影响。另外,我们尝试了绵羊受精卵显微注射法,同时注射talens质粒和k2打靶载体,当天胚胎移植,期望得到基因打靶阳性羔羊。[研究结果]:1.绵羊fecb基因的cold-pcrhrm检测本研究建立的绵羊fecb基因qpcrhrm分型方法,曲线分离清晰良好,检测下限为2%,用于320只湖羊的fecb基因分型,结果清晰准确。关联分析显示,湖羊bb型比b+型多产羔1.56只,支持fecb基因为湖羊多胎主效基因的观点。本研究建立的绵羊fecb基因cold-pcrhrm检测方法,将qpcrhrm的检测下限降到0.5%,检测重复性好。2.fecb突变阳性单克隆细胞株的制备结果经检测,talens质粒具有一定的作用活性,可以用于下游实验。打靶载体经测序检测,序列正确无误。细胞电转染和核转染的最高转染效率分别为70.6%和90%左右。共转染soo和共转染k2打靶载体的细胞,通过有限稀释法分别获得162个和99个单克隆细胞株,单细胞形成克隆效率分别为25.0%和30.1%,经过测序检测,均无fecb突变阳性的细胞株。共转染k1打靶载体的细胞经过两轮418筛选,共获得5个单克隆细胞株,其pcr产物测序,据峰图判断,没有突变纯合子,但有2个杂合子。初步鉴定的杂合子经pcr产物ta克隆再次测序,二者确定为杂合子。这2个细胞株形态正常,具有一定的活力,可以作为核移植供体,为阿勒泰羊fecb突变胚胎和个体的构建奠定了细胞基础。3.阿勒泰羊fecb突变胚胎和个体构建的结果在胚胎构建和发育实验中,我们以fecb突变阳性细胞为供体,通过核移植,共获得重构胚胎89个,卵裂率为69.9%,囊胚率为14.9%,和未经打靶处理的对照组相比,差别不显著。在胚胎移植实验中,我们共移植了14只代孕母羊,经过b超检查有2只疑为受孕,但最终没发现有流产或产羔情况。另外,TALENs表达质粒和K2打靶载体显微注射了合格的受精卵共计44个,胚胎移植了22只母羊。妊娠60 d后B超检查,妊娠率63.6%。流产1只,产羔13只,产羔率59%。经测序检测,流产胎儿和羔羊均为FecB阴性。[结论]本研究建立的低丰度FecB基因COLD-PCR HRM检测方法,适用于绵羊FecB基因的大群快速筛查工作,具有重复可靠性。本研究通过基因打靶,最终没有得到BMPR-1B基因FecB突变的阿勒泰羊个体,但获得了FecB突变杂合子单克隆细胞株和发育正常的重构胚胎,为FecB突变阿勒泰羊的重新构建以及FecB基因作用机理的研究提供了材料。