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苹果树腐烂病是由子囊菌黑腐皮壳属真菌Valsa mali引起的苹果树枝干病害。该病在我国普遍发生,能引起苹果树主干、主枝皮层腐烂,乃至整株枯死,严重影响我国苹果产业的发展。苹果树腐烂病的研究已深入到分子层面,但其治病机理尚不完全明确。苹果树腐烂病能降解根皮苷产生有毒物质,这些有毒物质能引起和树皮自然感病一样的腐烂症状,腐烂的组织内有大量微生物定殖,这些微生物与腐烂病菌之间能发生水平基因转移。本研究基于V.mali全基因组数据,鉴定到糖苷类水解酶(GH)家族Ⅰ的1个乳糖根皮苷水解酶(LPH)基因Vmlph1,及两个具有博来霉素抗性的水平转移基因(HGT)Vmhgt14和Vmhgt32。明确这三个基因在苹果树腐烂病菌侵染和治病过程中的作用,为探究病菌的适应机制及致病机理奠定基础。本研究利用Double-joint PCR构建基因敲除载体,结合PEG介导的原生质体转化对目的基因进行敲除,通过PCR检测及Southern Blot验证单拷贝突变体,并对突变体进行研究,取得如下结果:1.经PCR检测及Southern Blot验证,获得Vmlph1基因的敲除突变体1个。与野生型菌株03-8相比,ΔVmlph1-4菌落颜色变白,生长速率和产孢能力显著降低;接种到叶片和枝条上,突变体致病力分别降低22.0%和11.0%;但根皮苷降解能力没有显著差异;在根皮苷诱导下,野生型菌株03-8黑色素合成调控转录因子Cmr1基因表达量显著上调,但ΔVmlph1-4的Cmr1基因上调倍数显著低于野生型菌株。2.利用三种浓度博来霉素(10μg/mL、50μg/mL和100μg/mL)来检测苹果树腐烂病(Valsa mali)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)和禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)的抗性,与构巢曲霉(A.nidulans)和禾谷镰刀菌(F.graminearum)相比,苹果树腐烂病菌(V.mali)对博来霉素具有更显著的抗性。博来霉素(50μg/mL)诱导下,苹果树腐烂病菌Vmhgt14,Vmhgt32基因表达量均上调,且Vmhgt32基因上调倍数显著高于Vmhgt14基因。对Vmhgt32基因敲除后,ΔVmhgt32-1博来霉素抗性没有显著性变化,但ΔVmhgt32-1的Vmhgt14基因表达量在36 h时显著上调。对ΔVmhgt32-1菌株的Vmhgt14基因进行敲除,与野生型03-8相比,双敲除突变体ΔVmhgt32/14-60博来霉素抗性显著降低。与野生型03-8相比,ΔVmhgt32-1、ΔVmhgt32-37及ΔVmhgt32/14-60致病力没有显著变化。综合以上研究,说明苹果腐烂病菌Vmlph1基因与病菌营养生长、致病力、分生孢子的产生及黑色素合成有关;Vmhgt14与Vmhgt32基因共同作用于病菌的博来霉素抗性。