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硒是发挥着重要生物学功能的一种关键的微量元素。日粮中缺乏硒可造成鸡多种器官中发生一系列的临床和病理改变。与其它组织相比较,肾脏的硒含量较高,肾脏也是硒缺乏的靶器官之一,硒缺乏能够引起鸡肾功能衰退、氧化应激和肾纤维化,此外还影响细胞周期进程以及引起细胞凋亡,而硒补充则会缓解这些症状。有研究表明miRNAs也参与肾脏的许多疾病的发生,miR-33是高度保守的miRNA家族,它在许多疾病方面发挥着重要作用,其中也包括细胞周期及细胞凋亡,然而目前关于miR-33在缺硒肉鸡肾脏细胞凋亡中的作用还不清楚。为探讨miR-33-3p及其相应的靶基因在缺硒肾脏细胞周期及凋亡中的作用,本研究通过复制缺硒鸡模型,应用超微结构观察、实时荧光定量PCR技术、双荧光素酶报告基因、AO-EB等技术,检测了缺硒肾脏中β-catenin通路的一些相关基因(E-cadherin、β-catenin、cyclinD1、TCF、c-myc、survivin)及凋亡相关基因(Bcl-2、Bax、Bak、Caspase3)和去整合素域和金属蛋白酶域蛋白10(ADAM10)mRNA和蛋白的表达水平以及miR-33-3p的表达水平。在建立体外miR-33-3p过表达和敲低的鸡胚原代肾细胞模型基础上,预测并验证了miR-33-3p的靶基因是ADAM10,通过敲低和过表达体外培养的鸡胚原代肾细胞中的miR-33-3p,检测肾脏β-catenin通路相关基因及凋亡相关基因的表达。试验结果如下:(1)在建立体外培养鸡胚原代肾细胞细胞模型的基础上,成功构建了miR-33-3p过表达和敲低模型,过表达效率为46倍,敲低效率是0.45倍。利用生物信息学预测软件TargetScan和miRDB预测了miR-33-3p可以与ADAM10基因的3’UTR片段结合,表明ADAM10可能是miR-33-3p的一个靶基因。另外,通过构建双荧光素酶报告基因、RT-PCR和western blot的方法确认了ADAM10是miR-33-3p的靶基因之一。(2)低硒饲料能够引起鸡肾脏组织中miR-33-3p表达上调和ADAM10表达下调,miR-33-3p上调9倍,ADAM10表达下调46%,并且引起E-cadherin表达上调,而β-catenin、cyclinD1、TCF、c-myc、survivin表达下调,促凋亡基因Bak、Bax和Caspase3表达上调,相反的,抑凋亡基因Bcl-2表达下调,同时超微组织结构观察的结果发现缺硒中肾脏细胞凋亡率显著增多。上述结果表明,miR-33-3p及其靶基因ADAM10与低硒引起肾脏细胞凋亡相关。(3)为了确认miR-33-3p对鸡胚原代肾细胞的细胞周期及凋亡的影响,我们建立了鸡原代体外培养肾脏细胞miR-33-3p过表达和敲低模型,结果表明鸡胚原代肾细胞过表达miR-33-3p时,细胞周期相关基因(β-catenin、cyclinD1、TCF、c-myc、survivin)表达下调,细胞凋亡相关基因Bak、Bax和Caspase3表达水平上调,而Bcl-2则下调,同时通过流式细胞术检测转染miR-33-3p mimic之后细胞周期及细胞凋亡情况,结果表明转染miR-33-3p mimic后细胞周期阻滞,在G0/G1期细胞数量明显增加,细胞凋亡率也明显增加,而在鸡胚原代肾细胞中敲低miR-33-3p后,细胞中细胞周期及细胞凋亡相关基因的表达水平发生变化,细胞周期相关基因(β-catenin、cyclinD1、TCF、c-myc、survivin)表达上调,细胞凋亡相关基因Bak、Bax和Caspase3表达水平下调,而Bcl-2则上调,并且转染miR-33-3p inhibitor后则流式细胞术检测结果也表明细胞周期进程顺利进行且细胞凋亡率明显下降。最后我们通过AO-EB方法也证明在鸡胚原代肾细胞中过表达miR-33-3p会增加细胞凋亡率,而抑制细胞中的miR-33-3p水平则会降低细胞凋亡率。这些结果表明miR-33-3p能够通过抑制ADAM10表达引起鸡胚原代肾细胞发生细胞周期阻滞及细胞凋亡。综上所述,低硒日粮能够引起miR-33-3p表达上调,并通过负调控靶基因ADAM10,进一步促进了细胞周期阻滞及细胞凋亡。本试验为探索miRNA与硒缺乏之间的相互作用机制奠定了基础,并为防治缺硒性肾脏损伤机制提供理论依据。