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乳酸菌长期应用于食品发酵，是安全级微生物;同时它也是肠道菌群的正常组分，在胃肠道存活且有多重益生作用。因此，乳酸菌是合成食品添加剂、生物治疗药物等功能性产品的优良底盘细胞和传递载体。番茄红素是由8个异戊二烯单元构成的萜类化合物，作为自然界中的强抗氧化剂，它随着食物或药物进入人体后发挥抗氧化、抗辐射、防癌抗癌等多种生理作用。以食品级乳酸菌为宿主菌合成番茄红素具有安全性高、无需提取可直接以活菌形式服用等优势，展现出巨大的应用潜力。
乳酸乳球菌是乳酸菌研究的模式菌株，遗传背景清晰、代谢途径简单，操作工具较为完善，作为细胞工厂成功实现了多元醇、双乙酰以及重要医用分子的高效表达。由于番茄红素的代谢途径复杂，以乳球菌为底盘细胞合成番茄红素的研究鲜有报道，目前尚未实现其在乳球菌细胞内的大量合成。本论文以乳酸乳球菌NZ9000∷loxp为出发菌株，对菠萝泛菌来源的番茄红素合成相关基因crtEBI进行表达优化获得稳定合成番茄红素的重组菌株，通过发酵条件优化和代谢途径改造提高单位细胞内番茄红素的产量，并检测乳酸乳球菌合成番茄红素的抗氧化生理功能。具体实验结果如下:
1.构建合成番茄红素的重组乳酸乳球菌
生物体内番茄红素的合成需要经过多步反应，先由甲羟戊酸经过多步酶的催化合成法尼基焦磷酸，然后在限速酶牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶CrtE及八氢番茄红素合成酶CrtB、八氢番茄红素脱氢酶CrtI的进一步催化下生成番茄红素。经预测，乳球菌NZ9000基因组编码的番茄红素合成途径不完整，缺少crtB和crtI基因。为了实现在乳球菌中生产番茄红素，我们将来源于菠萝泛菌的crtE、crtB和crtI基因与大肠杆菌和乳酸菌的穿梭载体pLEISS连接，构建了由质粒携带crtEBI基因的诱导型和组成型重组菌株Lc.lactisNZ-crtEBI和Lc.lactisNZ-P207-crtEBI，同时利用Cre/loxp位点特异性重组系统构建了crtEBI基因在染色体上整合的诱导型和组成型重组菌株Lc.lactisNZ-int-crtEBI和Lc.lactisNZ-int-2Pldh-crtEBI。在无选择压力条件下将重组菌株NZ-crtEBI和NZ-int-crtEBI分别连续传代培养100代后，菌株NZ-crtEBI中携带crtEBI基因的重组质粒和菌株NZ-int-crtEBI基因组中15个拷贝的crtEBI基因均保持稳定，证明了重组菌株NZ-crtEBI和NZ-int-crtEBI的遗传稳定性。
高效液相色谱检测发现，由质粒携带crtEBI基因的诱导型重组菌株NZ-crtEBI和组成型重组菌株NZ-P207-crtEBI的番茄红素产量分别为0.59±0.00、0.11±0.00mg/L;crtEBI基因在染色体上整合的诱导型重组菌株NZ-int-crtEBI的番茄红素产量为0.54±0.04mg/L，而crtEBI基因在染色体上整合的组成型重组菌株NZ-int-2Pldh-crtEBI并未合成番茄红素。提取乳球菌NZ-crtEBI合成的番茄红素，质谱分析其分子量大小与番茄红素标准品一致，说明利用乳球菌成功实现了番茄红素的合成。对9个随机挑取的重组菌NZ-crtEBI的番茄红素产量和生物量之间的关系进行分析，结果发现番茄红素产量越高，菌体生物量越低，暗示乳球菌细胞的生长与番茄红素的合成存在竞争关系。
2.乳酸乳球菌合成番茄红素的发酵条件优化
乳酸乳球菌是兼性厌氧微生物，但在血红素存在下能进行有氧呼吸，提高菌体发酵密度。为了提高菌体生物量，对诱导型重组菌株NZ-crtEBI进行了培养基和培养条件优化。首先利用正交实验优化发酵培养基，结果发现在葡萄糖1％、酵母粉0.5％和蛋白胨0.5％时，番茄红素产量为0.83±0.10mg/L，细胞密度为1.90±0.05，产量较优化前提高了40.6％，同时乳酸、乙酸、双乙酰和乙偶姻含量分别为84.05±0.22mM、24.33±1.26mM、4.06±0.00mM和1.25±0.19mM。在此基础上，向培养基中添加4μg/mL的血红素，进一步优化了培养条件如初始pH、发酵温度和摇床转速，结果发现在pH为6.5，摇床转速为140rpm时，30℃培养12小时，番茄红素产量达到1.09±0.01mg/L，较未优化前提高了31.33％，OD600提高至3.17±0.01，较未优化前提高了66.84％。乳酸、乙酸、双乙酰和乙偶姻含量分别为61.80±2.58mM、26.13±0.05mM、4.21±0.14mM和11.39±0.31mM，说明有氧条件培养，有利于细胞密度和番茄红素产量的显著提高(P＜0.05)。
在5L发酵罐中进行了放大实验。当以30％的葡萄糖为碳源进行补料发酵，控制pH为6.5，曝气率为1L/min，发酵24小时，重组菌株NZ-crtEBI番茄红素产量达到2.01±0.46mg/L，OD600达到6.12±0.11。
3.阻断番茄红素前体物乙酰CoA的竞争途径
乙酰CoA是番茄红素的合成前体物，在乳球菌中乙酰CoA由丙酮酸在丙酮酸脱氢酶系的催化下生成，同时丙酮酸还在乳酸脱氢酶(LDH)的作用下生成乳酸、在α-乙酰乳酸合酶(ALS)的作用下生成α-乙酰乳酸，因此阻断LDH和ALS途径，为乙酰CoA合成提供更多的前体物丙酮酸，有利于提高番茄红素的产量。
利用CRISPR-Cas9辅助的ssDNA重组技术，敲除了Lc.lactisNZ9000∷loxp基因组中乳酸脱氢酶基因llmg_1120，或同时敲除α-乙酰乳酸合酶基因llmg_1309，分别得到敲除株Lc.lactisNZ△ldh和Lc.lactisNZ△ldh△als。将携带crtEBI的诱导型重组质粒pLEISS-Pnis-crtEBI电转化进入这两种敲除株，构建了重组菌株Lc.lactisNZ△ldh-crtEBI和Lc.lactisNZ△ldh△als-crtEBI。测定这些重组菌番茄红素的产量，在不添加血红素时，菌株NZ-crtEBI、NZ△ldh-crtEBI和NZ△ldh△als-crtEBI单位菌体的番茄红素产量为0.37、0.42和0.43mg/L/OD600;在有血红素存在时，番茄红素产量分别为0.31、0.5和0.4mg/L/OD600。结合乳酸、乙酸和乙偶姻等代谢产物的定量发现，阻断LDH途径迫使部分碳流向番茄红素和乙偶姻，同时阻断LDH和ALS途径使更多碳流向番茄红素。由此说明，LDH和ALS途径的阻断有助于细胞内番茄红素的积累。此外，在添加或不添加血红素时，重组菌株NZ△ldh-crtEBI和NZ△ldh△als-crtEBI与NZ-crtEBI相比，生物量显著降低，NADH/NAD+水平显著提高，说明阻断LDH途径后细胞内氧化还原不平衡从而影响细胞生长。
4.乳球菌合成番茄红素的抗氧化保护作用
番茄红素是一种天然脂溶性色素，具有很好的抗氧化活性。通过旋转蒸发制备了NZ-crtEBI合成的番茄红素粗制品，测定了其对于DPPH、O2-和·OH的体外清除率。当番茄红素浓度为5μg/mL时，对DPPH和O2-的清除率达50％和80％以上;当浓度为10μg/mL时，对·OH清除率达到20％以上，明显高于同浓度的抗氧化剂VC、VE和BHT的抗氧化能力。进一步探索了番茄红素赋予乳酸菌的抗氧胁迫能力，分别用2mM、4mM、6mMH2O2胁迫番茄红素合成株NZ-crtEBI和对照株NZ-pLEISS2小时，结果发现番茄红素合成株较对照株的存活率显著增加，证明番茄红素合成株NZ-crtEBI具有抗氧胁迫的能力。
为了探索番茄红素重组菌对肠上皮细胞氧化应激的保护作用，分别将野生株Lc.lactisNZ9000∷loxp与对照株NZ-pLEISS与肠上皮细胞NCM460共培养，使用H2O2胁迫4h后细胞的存活率分别为29.55％±2.56和30.50％±2.35，而与番茄红素合成株NZ-crtEBI共培养，H2O2胁迫4h后细胞的存活率为46.5％±5.20，较野生株和对照株具有极显著的提高(P＜0.01)，说明番茄红素合成菌株能有效的保护细胞NCM460免遭活性氧伤害，荧光正置显微镜的观察结果证实番茄红素合成株减弱细胞NCM460内ROS的水平。
乳酸乳球菌是乳酸菌研究的模式菌株，遗传背景清晰、代谢途径简单，操作工具较为完善，作为细胞工厂成功实现了多元醇、双乙酰以及重要医用分子的高效表达。由于番茄红素的代谢途径复杂，以乳球菌为底盘细胞合成番茄红素的研究鲜有报道，目前尚未实现其在乳球菌细胞内的大量合成。本论文以乳酸乳球菌NZ9000∷loxp为出发菌株，对菠萝泛菌来源的番茄红素合成相关基因crtEBI进行表达优化获得稳定合成番茄红素的重组菌株，通过发酵条件优化和代谢途径改造提高单位细胞内番茄红素的产量，并检测乳酸乳球菌合成番茄红素的抗氧化生理功能。具体实验结果如下:
1.构建合成番茄红素的重组乳酸乳球菌
生物体内番茄红素的合成需要经过多步反应，先由甲羟戊酸经过多步酶的催化合成法尼基焦磷酸，然后在限速酶牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶CrtE及八氢番茄红素合成酶CrtB、八氢番茄红素脱氢酶CrtI的进一步催化下生成番茄红素。经预测，乳球菌NZ9000基因组编码的番茄红素合成途径不完整，缺少crtB和crtI基因。为了实现在乳球菌中生产番茄红素，我们将来源于菠萝泛菌的crtE、crtB和crtI基因与大肠杆菌和乳酸菌的穿梭载体pLEISS连接，构建了由质粒携带crtEBI基因的诱导型和组成型重组菌株Lc.lactisNZ-crtEBI和Lc.lactisNZ-P207-crtEBI，同时利用Cre/loxp位点特异性重组系统构建了crtEBI基因在染色体上整合的诱导型和组成型重组菌株Lc.lactisNZ-int-crtEBI和Lc.lactisNZ-int-2Pldh-crtEBI。在无选择压力条件下将重组菌株NZ-crtEBI和NZ-int-crtEBI分别连续传代培养100代后，菌株NZ-crtEBI中携带crtEBI基因的重组质粒和菌株NZ-int-crtEBI基因组中15个拷贝的crtEBI基因均保持稳定，证明了重组菌株NZ-crtEBI和NZ-int-crtEBI的遗传稳定性。
高效液相色谱检测发现，由质粒携带crtEBI基因的诱导型重组菌株NZ-crtEBI和组成型重组菌株NZ-P207-crtEBI的番茄红素产量分别为0.59±0.00、0.11±0.00mg/L;crtEBI基因在染色体上整合的诱导型重组菌株NZ-int-crtEBI的番茄红素产量为0.54±0.04mg/L，而crtEBI基因在染色体上整合的组成型重组菌株NZ-int-2Pldh-crtEBI并未合成番茄红素。提取乳球菌NZ-crtEBI合成的番茄红素，质谱分析其分子量大小与番茄红素标准品一致，说明利用乳球菌成功实现了番茄红素的合成。对9个随机挑取的重组菌NZ-crtEBI的番茄红素产量和生物量之间的关系进行分析，结果发现番茄红素产量越高，菌体生物量越低，暗示乳球菌细胞的生长与番茄红素的合成存在竞争关系。
2.乳酸乳球菌合成番茄红素的发酵条件优化
乳酸乳球菌是兼性厌氧微生物，但在血红素存在下能进行有氧呼吸，提高菌体发酵密度。为了提高菌体生物量，对诱导型重组菌株NZ-crtEBI进行了培养基和培养条件优化。首先利用正交实验优化发酵培养基，结果发现在葡萄糖1％、酵母粉0.5％和蛋白胨0.5％时，番茄红素产量为0.83±0.10mg/L，细胞密度为1.90±0.05，产量较优化前提高了40.6％，同时乳酸、乙酸、双乙酰和乙偶姻含量分别为84.05±0.22mM、24.33±1.26mM、4.06±0.00mM和1.25±0.19mM。在此基础上，向培养基中添加4μg/mL的血红素，进一步优化了培养条件如初始pH、发酵温度和摇床转速，结果发现在pH为6.5，摇床转速为140rpm时，30℃培养12小时，番茄红素产量达到1.09±0.01mg/L，较未优化前提高了31.33％，OD600提高至3.17±0.01，较未优化前提高了66.84％。乳酸、乙酸、双乙酰和乙偶姻含量分别为61.80±2.58mM、26.13±0.05mM、4.21±0.14mM和11.39±0.31mM，说明有氧条件培养，有利于细胞密度和番茄红素产量的显著提高(P＜0.05)。
在5L发酵罐中进行了放大实验。当以30％的葡萄糖为碳源进行补料发酵，控制pH为6.5，曝气率为1L/min，发酵24小时，重组菌株NZ-crtEBI番茄红素产量达到2.01±0.46mg/L，OD600达到6.12±0.11。
3.阻断番茄红素前体物乙酰CoA的竞争途径
乙酰CoA是番茄红素的合成前体物，在乳球菌中乙酰CoA由丙酮酸在丙酮酸脱氢酶系的催化下生成，同时丙酮酸还在乳酸脱氢酶(LDH)的作用下生成乳酸、在α-乙酰乳酸合酶(ALS)的作用下生成α-乙酰乳酸，因此阻断LDH和ALS途径，为乙酰CoA合成提供更多的前体物丙酮酸，有利于提高番茄红素的产量。
利用CRISPR-Cas9辅助的ssDNA重组技术，敲除了Lc.lactisNZ9000∷loxp基因组中乳酸脱氢酶基因llmg_1120，或同时敲除α-乙酰乳酸合酶基因llmg_1309，分别得到敲除株Lc.lactisNZ△ldh和Lc.lactisNZ△ldh△als。将携带crtEBI的诱导型重组质粒pLEISS-Pnis-crtEBI电转化进入这两种敲除株，构建了重组菌株Lc.lactisNZ△ldh-crtEBI和Lc.lactisNZ△ldh△als-crtEBI。测定这些重组菌番茄红素的产量，在不添加血红素时，菌株NZ-crtEBI、NZ△ldh-crtEBI和NZ△ldh△als-crtEBI单位菌体的番茄红素产量为0.37、0.42和0.43mg/L/OD600;在有血红素存在时，番茄红素产量分别为0.31、0.5和0.4mg/L/OD600。结合乳酸、乙酸和乙偶姻等代谢产物的定量发现，阻断LDH途径迫使部分碳流向番茄红素和乙偶姻，同时阻断LDH和ALS途径使更多碳流向番茄红素。由此说明，LDH和ALS途径的阻断有助于细胞内番茄红素的积累。此外，在添加或不添加血红素时，重组菌株NZ△ldh-crtEBI和NZ△ldh△als-crtEBI与NZ-crtEBI相比，生物量显著降低，NADH/NAD+水平显著提高，说明阻断LDH途径后细胞内氧化还原不平衡从而影响细胞生长。
4.乳球菌合成番茄红素的抗氧化保护作用
番茄红素是一种天然脂溶性色素，具有很好的抗氧化活性。通过旋转蒸发制备了NZ-crtEBI合成的番茄红素粗制品，测定了其对于DPPH、O2-和·OH的体外清除率。当番茄红素浓度为5μg/mL时，对DPPH和O2-的清除率达50％和80％以上;当浓度为10μg/mL时，对·OH清除率达到20％以上，明显高于同浓度的抗氧化剂VC、VE和BHT的抗氧化能力。进一步探索了番茄红素赋予乳酸菌的抗氧胁迫能力，分别用2mM、4mM、6mMH2O2胁迫番茄红素合成株NZ-crtEBI和对照株NZ-pLEISS2小时，结果发现番茄红素合成株较对照株的存活率显著增加，证明番茄红素合成株NZ-crtEBI具有抗氧胁迫的能力。
为了探索番茄红素重组菌对肠上皮细胞氧化应激的保护作用，分别将野生株Lc.lactisNZ9000∷loxp与对照株NZ-pLEISS与肠上皮细胞NCM460共培养，使用H2O2胁迫4h后细胞的存活率分别为29.55％±2.56和30.50％±2.35，而与番茄红素合成株NZ-crtEBI共培养，H2O2胁迫4h后细胞的存活率为46.5％±5.20，较野生株和对照株具有极显著的提高(P＜0.01)，说明番茄红素合成菌株能有效的保护细胞NCM460免遭活性氧伤害，荧光正置显微镜的观察结果证实番茄红素合成株减弱细胞NCM460内ROS的水平。