【摘 要】
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叶黄素是自然界中具有较强抗氧化能力的一种类胡萝卜素,同时也是视网膜黄斑色素的重要组成成分,广泛应用于医药保健品、食品、饲料和化妆品等领域。为了探索叶黄素的发酵法合成,本文以酿酒酵母为操作平台,以动态调控为手段,从代谢途径中限速酶的挖掘、分子改造和平衡表达等方面出发,开展一系列代谢工程和合成生物学方面的应用基础研究,构建叶黄素生产菌株,实现了叶黄素的异源生物合成。根据叶黄素的天然生物合成途径进行基因
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叶黄素是自然界中具有较强抗氧化能力的一种类胡萝卜素,同时也是视网膜黄斑色素的重要组成成分,广泛应用于医药保健品、食品、饲料和化妆品等领域。为了探索叶黄素的发酵法合成,本文以酿酒酵母为操作平台,以动态调控为手段,从代谢途径中限速酶的挖掘、分子改造和平衡表达等方面出发,开展一系列代谢工程和合成生物学方面的应用基础研究,构建叶黄素生产菌株,实现了叶黄素的异源生物合成。根据叶黄素的天然生物合成途径进行基因挖掘,人工合成经过密码子优化的万寿菊来源的番茄红素ε-环化酶和红发夫酵母来源的番茄红素β-环化酶,发现β-环化酶（CrtYB）的活性远远强于ε-环化酶（OmLCYE）,形成大量副产物β-胡萝卜素而无法合成关键中间体α-胡萝卜素。通过引入温敏型调控蛋白Gal4M9,并将CrtYB置于CAL启动子下,使其表达受到温度控制,而对其余基因进行组成型表达,以此调整OmLCYE和CrtYB的表达顺序,成功实现了 α-胡萝卜素的合成。为了进一步提高α-胡萝卜素的比例,将OmLCYE与细胞膜定位序列融合,同时利用菌落颜色差异构建高通量筛选方法对OmLCYE进行定向进化,最终利用含细胞膜定位序列的ε-环化酶突变体（PMseV-C-OmLCYEF61N,菌株YTA08）将α-胡萝卜素/β-胡萝卜素的比例提升至1:1.5,α-胡萝卜素产量可达294.3 μg/L,为叶黄素的合成奠定了基础。为了构建完整的叶黄素异源合成途径,以上述产α-胡萝卜素菌株YTA08为宿主,进行羟化酶的筛选,得到底物专一性强且催化活性高的拟南芥来源的胡萝卜素β-羟化酶（CYP97A3）和ε-羟化酶（LUT1）,同时发现叶黄素在酿酒酵母中是有序合成的:α-胡萝卜素在CYP97A3的催化下形成玉米黄质,随后在LUT1作用下进一步生成叶黄素。通过增加限速酶CYP97A3的拷贝数,叶黄素产量可达595.3 μg/L（438 μg/g DCW）,同时α-胡萝卜素积累量为538.8 μg/L,说明代谢流主要转向了α-分支。由于万寿菊来源的番茄红素ε-环化酶活力低,需要在高拷贝游离质粒上表达,重新筛选了更高活力的番茄红素ε-环化酶,通过拟南芥来源的ε-环化酶（At-LCYE）基因的染色体整合构建了具有良好遗传稳定性的叶黄素生产菌株。同时,为了提高α-胡萝卜素的转化率,对胡萝卜素羟化酶的辅因子进行了筛选和优化表达,发现RFNR1和FD3作为还原酶时,羟化酶的催化活性较高。为了进一步提高叶黄素的产量,对番茄红素ε-环化酶、胡萝卜素卜羟化酶及其还原酶进行平衡表达,最终菌株YTL-AE-07（包含两个拷贝At-LCYE,三个拷贝CYP97A3和一个拷贝RFNR1、FD3）中叶黄素产量可达6.91 mg/L（1.88 mg/g DCW）,经过高密度发酵产量可达28.27 mg/L,这是目前报道的异源合成叶黄素的最高产量。在摇瓶发酵过程中发现,菌株YTL-AE-07过早积累类胡萝卜素,不利于细胞生长。为了解决生长与中间产物积累之间的矛盾,在接下来的研究中利用葡萄糖响应启动子和温敏调控系统,构建了一套葡萄糖浓度、温度双重响应的动态调控系统。首先,对碳源响应启动子PADH2进行了表征,确认其在YPD培养基中受到葡萄糖浓度的严格调控,即高浓度抑制、低浓度激活。随后,将菌株YTL-AE-07 的 δ-胡萝卜素合成途径中的组成型启动子替换成ADH2启动子,结合 δ-胡萝卜素转化的温度调控成功构建了多层次调控的叶黄素生产菌株,利用此系统可将细胞生长、关键中间产物δ-胡萝卜素积累和终产物叶黄素的合成分成三个阶段。在摇瓶培养中,菌株叶黄素产量可达19.92mg/L（4.53 mg/g DCW）,远高于两阶段培养的菌株,干渣含量达到与藻类相当的水平。该三阶段动态调控系统可同时解决细胞生长与产物积累之间的矛盾以及细胞途径内部竞争这两大关键问题。本项工作将为微生物发酵法生产叶黄素奠定基础,同时,在研究过程中开发的反应顺序调控和三阶段调控策略为其他天然产物的异源合成调控提供了新的思路。
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