大豆、玉米转基因成分的竞争定量PCR检测

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本实验以传统的大豆、玉米和转基因大豆、玉米为材料,通过PCR方法定性和定量检测大豆、玉米中转基因成分。通过此研究可进一步为转基因食品的检测工作提供相关的理论依据和实验方法。 实验以35S启动子和NOS终止子为研究对象。首先利用PCR和Southern杂交方法对大豆、玉米的转基因成分进行定性检测。然后分别以非同源和同源模板为竞争物对二者进行定量检测。 竞争定量PCR方法的关键问题是竞争物的制备。非同源竞争物的制备是以异源的E.coli基因组为模板,对其进行低严紧型扩增,将回收目的条带构建在T-easy载体上制备而成。同源模板竞争物是以pBI121为模板进行35S启动子和NOS终止子扩增,回收目的条带构建在T-easy载体上,然后进行测序。在PCR产物内部选择合适的酶切位点,在该酶切位点插入40bp的片段制备而成。 定量PCR过程中,首先确定与含量为1%GMO样品(500ng)浓度相当的同源内标物浓度和含量为2%GMO相当的非同源内标物的浓度。然后以确定的内标物浓度与不同含量的GMO样品(500ng)进行竞争PCR反应,以此进一步确定样品中GMO含量的范围。 实验结果表明,定性PCR检测35S启动子的最佳退火温度为58℃,NOS终止子的最佳退火温度为52℃。经Southern杂交进一步验证了PCR结果的可靠性。实验中非同源模板竞争定量PCR的检出限为2%;同源模板竞争定量PCR检出限为1%。对待测样品进行检测,在GMO含量大于2%时,两种方法检测结果一致。
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