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龋病,作为人类最常见的慢性疾病之一,是一种多因素作用下的细菌感染性疾病,其主要始动因子是牙菌斑生物膜。变异链球菌是公认的主要致龋菌。蔗糖的摄入与龋病的发生和发展有直接的关系,因此蔗糖替代物的使用对于龋病的控制和预防具有重要意义。甜茶苷是从天然中药植物甜茶中提取出来的一种高强度甜味剂。前期研究证明甜茶苷对浮游状态下变异链球菌生长、产酸、粘附有抑制作用,同时也被证明它会抑制浮游菌葡糖基转移酶的活性,减少水不溶性胞外多糖的产生。目的:本实验从生物膜的层面,研究甜茶苷作为糖代物对变异链球菌生物膜致龋性的影响,探讨甜茶苷的防龋作用,并通过比较不同培养条件对生物膜致龋相关毒力基因表达水平的影响,分析其可能的防龋机制,为进一步开发和利用甜茶苷提供可靠的理论依据,为龋病的预防工作提供一种崭新的思路。方法:1.甜茶苷对变异链球菌生物膜生长及产酸状况的影响配置含1%蔗糖、甜茶苷、木糖醇的BHI液体培养基及不额外添加甜味剂的BHI液体培养基(空白对照组),并将初始pH调至7.04,按标准菌悬液与各培养基溶液1:10(v:v)比例接种于96孔板中,37℃厌氧培养12、24、36、48、60、72、96h采用结晶紫染色法检测变异链球菌生物膜的生成量,并绘制生物膜生长曲线。同时,另取一 24孔板按上述操作培养,每24h用pH计测定培养基的pH值,并进行比较。2.甜茶苷对变异链球菌生物膜的生物量及菌活力的影响配置含1%蔗糖、甜茶苷、木糖醇的BHI液体培养基及不额外添加甜味剂的BHI液体培养基(空白对照组),按标准菌悬液与各培养基溶液1:10(v:v)比例接种于放有盖玻片的24孔板中,37℃厌氧培养5天,将盖玻片上的生物膜刮下重悬形成菌悬液后,测定生物膜的干重,并提取菌液中的可溶性蛋白,用BCA蛋白定量试剂盒测定其浓度。生物膜的菌活力采用稀释涂布平板法测量,将菌悬液接种到BHI固体培养基上,37。C厌氧培养48h,计算菌落形成单位(CFU)的数量,并用稀释因子校正结果,用生物膜干重做标准化,表示为log10cfu/mg。3.甜茶苷对变异链球菌生物膜形态结构的影响利用96孔板上盖制备树脂片,配置含1%蔗糖、甜茶苷、木糖醇的BHI液体培养基及不额外添加甜味剂的BHI液体培养基(空白对照组),按标准菌悬液与各培养基溶液1:10(v:v)比例接种于放有树脂片的24孔板中,37℃厌氧培养48h,将覆有生物膜的树脂片取出,乙醇梯度脱水,冷冻干燥,在扫描电镜下观察各组变异链球菌生物膜的形态结构特点,并比较。4.甜茶苷对变异链球菌生物膜多糖含量的影响配置含1%蔗糖、甜茶苷、木糖醇的BHI液体培养基及不额外添加甜味剂的BHI液体培养基(空白对照组),按标准菌悬液与各培养基溶液1:10(v:v)比例接种于放有盖玻片的24孔板中,37℃厌氧培养5天,将盖玻片上的生物膜刮下重悬形成菌悬液后,分别提取水溶性胞外多糖(SEPS)、水不溶性胞外多糖(IEPS)、胞内多糖(IPS),采用苯酚硫酸法测定多糖的生成量,并比较。5.甜茶苷对变异链球菌生物膜致龋相关基因表达的影响配置含1%蔗糖、甜茶苷、木糖醇的BHI液体培养基及不额外添加甜味剂的BHI液体培养基(空白对照组),按标准菌悬液与各培养基溶液1:10(v:v)比例接种于放有盖玻片的24孔板中,37℃厌氧培养5天,将盖玻片上形成的生物膜刮下重悬形成菌悬液后,提取RNA,反转录后,采用实时荧光定量PCR测定生物膜中致龋相关毒力因子的表达水平,并进行比较。结果:1.蔗糖组培养基中生物膜的量一直远多于其他三组(P<0.05)。对照组与木糖醇组生物膜的生成量在12h时无统计学差异(P>0.05),12h后木糖醇组少于对照组(P<0.05)。甜茶苷组在培养24h时生物膜的生长达到顶峰,与其它组相比,形成的生物膜是最少的(P<0.05)。蔗糖组细菌培养24h后,pH迅速降至5.5(牙釉质脱矿临界pH)以下,并一直保持最低水平,而且pH值随时间增长而逐渐降低(P<0.05)。在24h时,木糖醇组pH高于对照组,而在120h时,木糖醇组则比对照组低,其余时间两组pH值差异无统计学意义(P>0.05)。甜茶苷组pH值在四组中一直是最高的(接近7),而且pH值随时间变化不明显(P>0.05)。2.蔗糖培养基中形成的生物膜干重高于其他处理组(P<0.001),木糖醇组与对照组差异无统计学意义(P>0.05),而甜茶苷组干重量最低(P<0.01)。蔗糖中生物膜总可溶性蛋白含量显著高于甜茶苷、木糖醇和对照组(P<0.001),其余三组的差异无统计学意义(P>0.05)。在蔗糖培养基生长的生物膜的活菌数高于甜茶苷、木糖醇和对照组(P<0.05),木糖醇组平板计数结果略低于对照组(P<0.05),而甜茶苷组活菌数与其他组相比,数量明显降低(P<0.05)。3.扫描电镜放大10000倍和30000倍观察,空白对照组生物膜上的细菌形态规则,结构完整,胞外基质较少,细菌数量少,零散分布,呈链条状,无明显的团状网络状结构。在蔗糖中,变异链球菌数量增多,菌链变长、增多,细菌产生大量无定形胞外基质物质,使细菌被包裹在这些胞外基质所形成的三维立体结构中。甜茶苷和木糖醇中生物膜的菌数量减少,菌体表面的胞外基质较少,细菌呈短链状分散分布,三维立体结构不明显。但木糖醇和甜茶苷之间的差异不显著。4.蔗糖中的生物膜水溶性胞外多糖(SEPS)的含量高于其他三组(P<0.001),而木糖醇和空白对照组SEPS含量差异无统计学意义(P>0.05),甜茶苷组生物膜SEPS含量是最少的(P<0.05)。蔗糖中生长的生物膜水不溶性胞外多糖(IEPS)的含量最多(P<0.001),甜茶苷组IEPS最少(P<0.05),木糖醇和空白对照组介于两者之间。而胞内多糖(IPS),蔗糖组生物膜的糖量是最高的(P<0.001),而其他三组含量的差异无统计学意义(P>0.05)。5.与多糖合成相关的基因(gtfB、gtfC、gtfD、ftf)在蔗糖组中显著上调,高于其它组(P<0.001)。甜茶苷中gtfB和gtfC的表达水平低于木糖醇(P<0.05)。甜茶苷、木糖醇与对照组中gtfD的表达差异无统计学意义(P>0.05),甜茶苷中ftf的表达略高于木糖醇组(P<0.01)。与粘附有关基因中,spaP在甜茶苷和木糖醇中的表达与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05),但均远低于蔗糖(P<0.001)。在蔗糖存在下,gbpB的表达水平在四组中是最高的(P<0.001)。而gbpB在甜茶苷中的表达比对照组轻微上调(P<0.05),但远低于木糖醇和蔗糖组(P<0.05)。在与产酸和耐酸性相关的基因中,甜茶苷中ldh表达水平与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05),均低于蔗糖(P<0.001)和木糖醇(P<0.01)。而atpF在甜茶苷中的表达比对照组和木糖醇组有所上调(P<0.001),但远低于蔗糖(P<0.001)。与应激调控系统相关基因中,vicR在蔗糖中与其他组相比是上调的(P<0.001),在甜茶苷和木糖醇中表达呈下调水平(P<0.05),但两组间差异无统计学意义(P>0.05)。而comD在甜茶苷中的表达与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),但低于木糖醇(P<0.05)。comD在蔗糖培养基中的表达水平是最高的(P<0.001)。结论:1.甜茶苷可以抑制变异链球菌生物膜的生长和产酸。2.甜茶苷会降低变异链球菌生物膜的生物量及菌活力。3.扫描电镜下发现甜茶苷可以抑制细菌的粘附,减少胞外基质的分泌,形成的生物膜较薄,三维立体结构不明显。4.甜茶苷能减少变异链球菌生物膜中水不溶性胞外多糖、水溶性胞外多糖、胞内多糖的合成。5.甜茶苷会影响变异链球菌生物膜致龋相关毒力基因的表达,使与粘附相关的spaP、gbpB基因、与多糖合成相关的gtfB、gtfC、gtfD和ftf基因、产酸和耐酸相关的ldh和atpF基因、应激调控相关的vicR和comD基因表达水平降低。这种基因表达的差异有可能导致了甜茶苷对变异链球菌生物膜生长、产酸、生物量、菌活力、多糖量、黏附性等方面的影响。本实验的研究结果显示,甜茶苷这一天然来源的甜味剂,有潜力作为蔗糖替代物应用在龋病防治领域,具有很高的开发利用价值以及广阔的市场前景。