【摘 要】
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甜菜素是安全的水溶性食用色素,具有抗氧化活性和光学活性,在保健食品、荧光成像等领域有潜在的应用价值。本文研究了甜菜来源的P450酶BvCYP76AD1LL与Bv CPR在大肠杆菌中表达合成甜菜醛氨酸的效果。将甜菜黄素的途径分配到两个菌中,设计并构建工程大肠杆菌共培养系统,实现了组氨酸-甜菜黄素的从头生物合成。对BvCYP76AD1LL进行了N-端22个氨基酸的截短（Bvt CYP76AD1L）和不
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甜菜素是安全的水溶性食用色素,具有抗氧化活性和光学活性,在保健食品、荧光成像等领域有潜在的应用价值。本文研究了甜菜来源的P450酶BvCYP76AD1LL与Bv CPR在大肠杆菌中表达合成甜菜醛氨酸的效果。将甜菜黄素的途径分配到两个菌中,设计并构建工程大肠杆菌共培养系统,实现了组氨酸-甜菜黄素的从头生物合成。对BvCYP76AD1LL进行了N-端22个氨基酸的截短（Bvt CYP76AD1L）和不同的N-端修饰,与截短的Bvt CPR共表达,研究了单顺反子、双顺反子及融合表达对合成L-多巴的影响。结果表明,三种N-端修饰中,亲水性2B1序列（MAKKTSS）优于MA,而疏水性17A序列（MALLLAVF）效果最差。以GST或GSTSSG为接头进行融合表达,发酵液中没有检测到L-多巴的生成。发酵24h,单顺反子表达2B1-Bvt CYP76AD1L和Bvt CPR的菌株合成28.56mg/L的L-多巴,而双顺反子表达菌株产量最高,合成了40.42mg/L的L-多巴,表现出N-端修饰和表达模式的组合效应。利用大肠杆菌酪氨酸羟化酶hpa BC和甜菜多巴双加氧酶Mj DODA,构建高和中拷贝数的两种表达载体,与2种高产L-酪氨酸的底盘进行适配,得到利用葡萄糖从头合成甜菜醛氨酸的菌株BTA6。外源添加20种蛋白类氨基酸,合成了10种氨基酸-甜菜素;添加2种非蛋白质类氨基酸（对氨基苯甲酸和L-多巴）、4种胺类（多巴胺、酪胺、吲哚啉、吡咯烷）,合成了6种对应的甜菜黄素。表明工程大肠杆菌BTA6具有合成多种结构不同、颜色不同的甜菜素的能力。通过基因组工程,对his G基因进行定点突变(his GE271K),用人工阅读框his L’替换his L,解除合成的抑制,同时质粒过表达his L’-his GE271K,构建了L-组氨酸合成菌株BHS3,发酵24h,L-组氨酸产量为422.60mg/L。将BHS3与BTA6共培养,实现了组氨酸-甜菜黄素的从头合成。优化培养条件,使共培养系统趋于稳定,初始接种比例BTA6/BHS3为12:1,接种浓度OD600为3时,不添加诱导剂,使用含有酵母提取物的M9培养基,摇瓶发酵24h,从头合成了287.69mg/L的组氨酸-甜菜黄素。采用微生物共培养策略,将甜菜素合成途径拆分为甜菜醛氨酸途径和氨基酸途径两个部分,为构建混菌细胞工厂,高效合成甜菜素类化合物提供了一种全新方法。
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