目的：通过检测体外诱生培养过程中人外周血淋巴细胞表面几种白介素受体(IL-R)、共刺激分子和凋亡受体/配体的动态表达情况，以及细胞周期的变化，初步探讨人T细胞在体外诱生培养过程中对细胞因子的需求状况及其与T细胞活化增殖和凋亡的关系，从而为试验研制复合优化的T细胞条件培养基提供理论基础和实验依据。 方法：采用Ficoll密度梯度离心结合培养皿贴附法，无菌分离人外周血淋巴细胞，置不同培养条件下进行培养；用免疫荧光、免疫酶染色结合细胞ELISA(CELISA)法，于不同培养时间点(0、1、3、5、7、9、11、14d)动态观测白介素受体IL-1R、IL-2R、IL-3R、IL-7R、IL-12R、IL-18R，共刺激分子CD27、CD28、4-1BB，凋亡相关分子CD95(Fas)、CD178(FasL)的表达情况；以台盼蓝染色法同步观测各培养组的死、活细胞数及细胞总数，绘制生长曲线；并于培养第3天采用MTT法检测细胞增殖情况，采用流式细胞仪(FCM)分析各培养组细胞周期的变化。 结果：1.不同培养条件下淋巴细胞表面几种免疫相关分子动态表达 (1)培养前不同免疫相关分子的表达水平 IL-2Rγ表达较高，其次为4-1BB和IL-3R，而IL-1Rα、IL-2Rα、IL-7R、IL-12R、IL-18R、CD27、CD28、Fas和FasL表达较低。免疫染色观察和CELISA检测结果一致。 (2)不同培养时间点免疫相关分子的表达变化 5％FBSRPMI1640培养组(以下简称1640组)：IL-1Rα在培养第1天仍表达较低，第3天表达较高，以后各天变化不大；IL-2Rα的表达于第1天即增强，到第11天仍表达较高，第14天表达减弱；IL-2Rγ一直表达较高，培养后呈现逐渐增高的趋势；IL-3R于第3天表达增强，以后持续表达较高；IL-7R的表达在第3～7天较高，第9天后表达渐弱；IL-12R于第3～5天表达较强，第7天即下降；IL-18R于第5天才表达增强，至第14天维持较高表达；CD28在第1～7天表达较高，第9天后逐渐下调；CD27于第5天才表达渐强，后持续较高表达；4-1BB的表达于第1～7天进一步增强，第9天后下降；Fas的表达在第1～9天呈持续上升趋势，第11天达高峰，第14天下降。FasL于第1天即表达增强，第7天达高峰，第9天后下调，但仍维持较高表达水平。 1640+IL-2培养组(以下简称IL-2组)：总的看来，IL-2组培养的淋巴细胞各免疫相关分子的表达分别较强于1640组，但较1640+PHA组为低。培养第1天，IL-1Rα表达更弱，IL-3R、IL-7R、IL-12R、IL-18R、CD28、Fas和FasL表达增强；第3天，IL-1Rα、IL-2Rα、IL-2Rγ、CD27、4-1BB表达增强；5～7天时，IL-2Rα和IL-2γ的表达进一步增高达峰值，而IL-12R、IL-18R和Fas有所下调；9～14天，除CD27维持较高表达外，其余分子的表达均呈下调趋势。 1640+PHA培养组(以下简称PHA组)：三种培养条件中，以PHA组培养的淋巴细胞其免疫分子表达最高，表达趋势略有不同。培养第1天，多数免疫分子的表达增强，CD27、4-1BB变化不大；第3天，CD27、4-1BB表达增高，IL-2Rγ、IL-18R、CD28、Fas、FasL达峰值，其余分子也维持较高表达；5～7天，IL-12R、CD28的表达开始减低；9～11天，IL-2R、IL-7R、18R、Fas和FasL的表达下降；至14天时，IL-1Rα、IL-3R、CD27、4-1BB的表达仍较高，而多数免疫分子的表达则呈下调趋势。 2.不同培养条件下人血淋巴细胞的增殖情况 (1)MTT试验 培养第3天，IL-2组培养的细胞所形成的甲臢颗粒及其OD490值略高于1640组；PHA组、CD3McAb+IL2组、CD3McAb+CD28McAb+IL2组、CD3McAb+CD28McAb+IL2+IL1α组，其细胞增殖成团，甲臢颗粒融成片状，OD490值均显著高于1640组和IL-2组；CD3McAb+IL2组、CD3McAb+CD28McAb+IL2组、CD3McAb+CD28McAb+IL2+IL1α组分别与PHA组比较，CD3McAb+IL2组的OD490值低于PHA组，而后两组的OD490值与PHA组无显著差异。结合培养细胞计数及各组细胞增殖曲线，可以看出，CD3McAb+CD28McAb+IL2+IL1α组具有较强的增殖活力。 (2)生长曲线的增殖倍数 不同组别培养的细胞随时间呈不同程度的持续增殖状态，在17天左右达增殖高峰。在培养第17天时，PHA组细胞扩增倍数达121.447±11.488倍；CD3McAb+IL-2组与CD3McAb+CD28McAb+IL2组，扩增倍数分别为106.873±12.413倍和137.877±14.472倍，其增殖倍数与PHA组比较无明显差异；而CD3McAb+CD28McAb+IL2+IL1α组，细胞扩增倍数在第17天时达151.497±20.378倍，其增殖倍数大于PHA组。 结论1.淋巴细胞在体外诱生培养前和培养后不同时间几种白介素受体、共刺激分子及凋亡相关分子的表达存在动态变化。总体表达趋势为培养第1～3天表达增强、5～7天达高峰、9～14天逐渐降低；表达强度依次为PHA组、IL-2组、1640组；PHA组培养的淋巴细胞各种膜免疫分子表达峰值的时间明显前移。结果反映了体外培养过程中淋巴细胞的复合生长因子需求、增殖活性及凋亡状况，为试验研制复合优化的T细胞条件培养基提供了实验参考依据。 2.T淋巴细胞体外复合诱生培养方法初步探索的试验结果提示：CD3McAb+CD28McAb+IL2+IL1α的复合培养基配方优于单独IL-2、CD3McAb+IL2、CD3McAb+CD28McAb+IL2组合的刺激，接近甚至优于PHA刺激。该组配方，或再结合其它细胞因子或PHA，可能在体外大量诱生培养T细胞/肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)转而用于肿瘤过继细胞免疫治疗方面具有应用前景。 3.CELISA的改建方法，简便可行且无放射性污染，可望能作为一种大规模定量检测细胞表面受体/分子表达的有效方法。