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脓毒症（sepsis）是指微生物入侵机体感染后所致的全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome , SIRS）,临床上主要表现为发热或体温下降、白细胞增多或减少、心动过速、呼吸急促等症状,进一步发展可导致严重脓毒症（severe sepsis）、脓毒性休克（septic shock）甚至多器官功能障碍综合征（MODS）。脓毒症的病理生理机制比较复杂,目前认为是由于机体免疫系统对侵入病原体的过度的炎症反应和凝血反应等导致机体组织器官损害,并引起循环紊乱及其他一系列的损害。其分子机制目前认为是感染后炎症细胞活化产生多种促炎细胞因子,而这些促炎细胞因子又可导致炎症细胞激活,两者互为因果形成炎症级联反应并逐级放大,最终全身播散引起脓毒症。髓系细胞触发受体（Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells , TREM）-1是由Bouchon等在2000年发现的一种跨膜受体蛋白,为免疫球蛋白超家族成员,主要表达于中性粒细胞和单核细胞表面。脓毒症时TREM-1表达明显上调,而相关研究也表明作为脓毒症炎症信号转导关键分子,TREM-1在脓毒症的发生发展中有重要作用。TREM-1作用主要通过与其天然配体结合后激活TREM-1/DAP12信号通路,进而增强炎症因子释放、炎症细胞浸润和增强中性粒细胞的致炎作用。由于TREM-1信号通路在脓毒症中有重要作用,目前TREM-1的天然配体尚不明,配体研究有助于阐明TREM-1分子通路机制,能为诊治脓毒症提出有效的分子诊治策略。相关研究发现在脓毒症患者送检标本中金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌为常见的病原菌;而热失活的金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌孵育处理单核细胞和中性粒细胞后TREM-1和相应炎症因子如TNF-α、IL-1β的表达均明显上调,提示TREM-1配体可能存在这些细菌上。目的本实验通过测定人中性粒细胞和单核细胞经热失活的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和结核分枝杆菌三种细菌的菌体、细胞壁和细胞壁组分进行处理后细胞TREM-1 mRNA水平变化和细胞培养上清中TNF-α和IL-1β浓度变化,研究各处理方法对TREM-1信号通路影响,进而确定TREM-1天然配体可能性质。方法取健康志愿者外周静脉血,密度梯度离心法分离人外周血单核细胞和中性粒细胞并进行原代培养。培养金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和结核分枝杆菌标准菌株;高渗透压诱导培养细胞壁缺陷的金黄色葡萄球菌L型和铜绿假单胞菌L型。离心对数期标准菌、金黄色葡萄球菌L型和铜绿假单胞菌L型获得菌体,经热灭活后分别将100μl浓度为1×109/ml金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、结核分枝杆菌、金黄色葡萄球菌L型及铜绿假单胞菌L型加入中性粒细胞悬液和单核细胞悬液,置37℃,5% CO2条件细胞培养箱培养24h。玻璃珠破碎法破碎菌体,超声提取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和结核分枝杆菌细胞壁,分别加入上述三种细胞壁于原代培养的中性粒细胞悬液和单核细胞悬液,置37℃,5%CO2条件细胞培养箱培养24h。十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法提取细胞壁多糖,氯仿-甲醇法提取脂类,硫酸铵盐析法提取细胞壁蛋白,加入三种细菌细胞壁组分于原代培养的中性粒细胞悬液和单核细胞悬液,置37℃,5%CO2条件培养24h。取孵育后各处理组中性粒细胞和单核细胞提取mRNA,逆转录为cDNA并以GAPDH为内参基因,荧光定量PCR检测TREM-1 mRNA水平,ELISA双抗体夹心法检测细胞培养上清中TNF-α和IL-1β浓度。结果1.中性粒细胞和单核细胞经金黄色葡萄球菌菌体、铜绿假单胞菌菌体、金黄色葡萄球菌细胞壁和铜绿假单胞菌细胞壁处理后TREM-1 mRNA水平上调,细胞培养上清中TNF-α、IL-1β浓度明显升高（P<0.05）;能与配体竞争性结合的LP17可以削弱此效应（P<0.05）。中性粒细胞和单核细胞经结核分枝杆菌菌体、结核分枝杆菌细胞壁和结核分枝杆菌细胞壁成分处理后TREM-1 mRNA水平、细胞培养上清中TNF-α和IL-1β浓度与空白对照无明显差异（P>0.05）。2.中性粒细胞和单核细胞经细菌细胞壁成分处理后,与空白组相比,金黄色葡萄球菌细胞壁多糖处理后中性粒细胞TREM-1 mRNA水平上调3.86±0.20倍,单核细胞TREM-1 mRNA水平上调5.15±0.56倍（P<0.05）;铜绿假单胞菌细胞壁多糖处理后中性粒细胞TREM-1 mRNA水平上调4.03±0.15倍,单核细胞TREM-1 mRNA水平上调7.22±0.73倍（P<0.05）,细胞培养上清中TNF-α和IL-1β浓度明显升高,能竞争性结合配体的LP17可以削弱此效应（P<0.05）。中性粒细胞和单核细胞分别经金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白、金黄色葡萄球菌细胞壁脂类、铜绿假单胞菌蛋白、铜绿假单胞菌脂类、结核分枝杆菌细胞壁蛋白、结核分枝杆菌细胞壁脂类和结核分枝杆菌细胞壁多糖处理后TREM-1 mRNA水平、细胞培养上清中TNF-α、IL-1β浓度与空白组相比均无明显变化（P>0.05）。3.中性粒细胞和单核细胞经上述方法处理后细胞培养上清中TNF-α及IL-1β浓度与TREM-1 mRNA水平变化趋势一致（P<0.05）。结论本实验结果证明人TREM-1配体可能位于细菌的细胞壁上,如金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的细胞壁,其成分可能为细胞壁的多糖分子。