【摘 要】
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水稻细胞质雄性不育性与细胞中线粒体基因紧密相关,研究线粒体基因及线粒体内蛋白是了解水稻CMS（Cytoplasmic male sterility）的一条重要途径。本实验室前期对HL-CMS水稻YTA的研究中克隆了一个新的CMS相关序列HL-sp1,该序列与已知的HL-CMS相关基因orfH79没有同源性。生物信息学分析发现HL-sp1中包含一段编码290个氨基酸的开放阅读框（ORF）,将其命名为
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水稻细胞质雄性不育性与细胞中线粒体基因紧密相关,研究线粒体基因及线粒体内蛋白是了解水稻CMS（Cytoplasmic male sterility）的一条重要途径。本实验室前期对HL-CMS水稻YTA的研究中克隆了一个新的CMS相关序列HL-sp1,该序列与已知的HL-CMS相关基因orfH79没有同源性。生物信息学分析发现HL-sp1中包含一段编码290个氨基酸的开放阅读框（ORF）,将其命名为orf290。对ORF290的分析表明它是N端具有2个跨膜结构域的线粒体膜蛋白,通过膜蛋白酵母双杂交筛选到两个ORF290的潜在互作蛋白APX8和E37,本研究在此基础上通过酵母点对点、BiFC、GST pull-down等实验进一步验证ORF290与APX8、E37的相互作用关系,取得以下结果:1.利用Plant-mPLoc预测发现APX8、E37均定位在线粒体和叶绿体中。STRING结果表明APX8编码478个氨基酸的抗坏血酸过氧化物酶,涉及抗坏血酸稳态和细胞中活性氧的清除。E37编码37KDa的MPBQ/MSBQ甲基转移酶,主要参与生育酚（维生素E）和质体醌合成的关键甲基化步骤,参与保护机体氧化还原的稳态。2.通过酵母点对点和Lac Z显色反应,证明ORF290、ORF290C在真核酵母细胞中与APX8、E37存在相互作用。通过Gateway方法构建了ORF290、ORF290C及APX8、E37表达载体,并在烟草叶表皮细胞中通过BiFC验证了ORF290、ORF290C与APX8、E37具有相互作用。构建了pET-32a-orf290/orf290C、pGEX6p-1-APX8/E37原核表达载体,在体外成功诱导融合蛋白,Pull-down实验结果表明存在相互作用。并且3种方法都证明了ORF290通过其C端与APX8、E37发生互作。3.构建了包含His标签的APX8、E37重组质粒载体并与ORF290诱饵蛋白载体共转酵母菌株,在RNA和蛋白水平验证了其表达,并且互作蛋白定位于膜系统。生长曲线结果表明当ORF290在酵母中与APX8、E37互作后,酵母的生长受到抑制,菌株ATP水平相对于对照组明显降低。4.构建了APX8、E37 RNAi干涉表达载体p DS1301-APX8/E37并遗传转化NIP、YTB,目前正在分化阶段。
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