【研究背景】乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤,严重威胁女性的生命健康。在欧洲发达国家如瑞典,乳腺癌发病率位居女性恶性肿瘤首位。在我国,乳腺癌的发病率也逐年增高,在北京、上海等沿海大城市,已达女性恶性肿瘤的首位。近年来,许多研究表明染色体不稳定性及肿瘤细胞DNA非整倍体是恶性肿瘤特征性标志之一。检测和分析肿瘤细胞DNA含量与DNA倍体对肿瘤恶性生物学行为的判断具有重要的价值。在乳腺癌中,非整倍体肿瘤(Aneuploid tumors,A-tumors)较二倍体肿瘤(Diploid tumors,D-tumors)生长迅速,侵袭性强。比较基因组杂交(comparative genomic hybridization,CGH)检测结果显示,非整倍体肿瘤较二倍体肿瘤具有更多的基因改变,包括基因重排、基因缺失、基因扩增等。除了染色体不稳定性外,乳腺癌肿瘤细胞的高增殖状态与肿瘤生长、演进、远处转移、死亡及化疗敏感性密切相关。免疫组化检测增殖细胞标记物,如Ki67、各种细胞周期蛋白(cyclin A,cyclin D1等),能反映肿瘤细胞的增殖水平。有研究表明Ki67和cyclin A表达高与乳腺癌预后差有关。Ki67表达于除G0期以外的各个细胞周期时相,包括G1期、S期、G2期和M期;而cyclinA在细胞周期S期和G2/M期有稳定表达。Cyclin A/Ki67比值反映了通过G1期检查点进入S期的肿瘤细胞占所有增殖肿瘤细胞的比例。Cyclin A/Ki67比值高,说明有大量不成熟的肿瘤细胞通过G1检查点进行复制、分裂,进而导致基因组不稳定性增加,与乳腺癌的恶性进展有关。肿瘤细胞的最基本特征是细胞的失控性生长,细胞周期检测点是调控细胞周期中DNA合成和有丝分裂高度有序进行的关键机制。CCND1位于11q13,编码产物是Cyclin D1,在细胞周期G1-S期转换中具有重要的调节作用,Cyclin D1过表达发生于40-90%的浸润性乳腺癌,其中5-20%的患者有CCND1基因的扩增。细胞周期检测点激酶1(Check point kinase1,Chk1)是一种进化上高度保守的蛋白质激酶,在S期、G2/M检测点调控细胞周期的进程。Chk1定位于11q24,在肿瘤的发生发展、凋亡和耐药机制中起重要作用。chk1的多态性或缺陷增加了基因的不稳定性,有助于具有突变表型的肿瘤细胞的形成和发展。CCND1和chk1基因的正常对于细胞周期的正常调节和基因稳定性有作用。利用高分辨率荧光原位杂交(FISH)技术可以直观地检测乳腺癌石蜡标本中CCND1和Chk1基因拷贝数的改变。本研究分为两部分。第一部分研究内容是分析肿瘤细胞增殖活性和基因不稳定性在乳腺癌预后中的作用。由于肿瘤存在异质性,不同区域肿瘤细胞的增殖水平不同。为了准确比较两增殖指标,本课题采用了连续组织切片,检测乳腺癌肿瘤标本中Ki67和cyclin A的表达,计数相同组织学视野Ki67和cyclin A的阳性细胞百分数。将肿瘤细胞增殖水平和DNA倍体结合,同时考虑患者腋窝淋巴结转移情况和肿瘤大小,筛选出与乳腺癌远处转移发生有关的高风险组和低风险组患者。对378例有9年以上完整随访资料的乳腺癌患者进行生存曲线及Cox多因素回归分析,探讨肿瘤细胞增殖水平、DNA倍体、组织学分级、肿瘤大小和腋窝淋巴结转移情况与患者乳腺癌复发和死亡的关系。我们同时分析了cyclin A/Ki67比值及cyclin A细胞浆表达与乳腺癌恶性生物学行为的关系。第二部分,我们选择了33例浸润性导管同时伴有灶性导管原位癌(DCIS)分化的石蜡标本,应用高分辨率FISH技术检测CCND1和Chk1基因拷贝数的改变,分析两者与临床病理各指标间的关系。同时探讨了cyclin D1蛋白的表达及细胞内的分布及与CCND1扩增的关系。两部分内容结合,从不同分子水平探讨了肿瘤细胞增殖、细胞周期调节和基因不稳定性与乳腺癌恶性行为和患者预后的关系。【方法】第一部分:收集瑞典卡罗林斯卡医院1998-1999乳腺癌患者428例,其中378例有完整的9年以上随访资料。所有石蜡标本4μm连续切片,免疫组化检测Ki67、cyclin A表达情况。两位病理医生显微镜下观察Ki67和cyclinA的表达,对每一病例选取5—14个形态学相同的高倍镜视野进行照相,传出到电脑。两人分别计数Ki67和cyclin A表达的阳性细胞百分数(每一病例计数的肿瘤细胞总数不少于1000个)。根据ROC曲线分析结果,Ki67阳性细胞数大于15%(或cyclin A≥8%)的肿瘤定义为高增值水平肿瘤,反之为低增殖水平肿瘤。采用Feulgen染色方法检测乳腺癌印片标本DNA倍体。DNA倍体主峰值在1.5c-2.5c之间且＜10%的肿瘤细胞超过2.5c的肿瘤定义为二倍体肿瘤。DNA倍体主峰值位于二倍体区域之外以及DNA倍体分布超过四倍体(3.5c-4.5c)范围的肿瘤定义为非整倍体肿瘤。SPF值(S-phase fraction)通过计算DNA分布获得。第二部分:选择山东大学附属齐鲁医院手术切除乳腺浸润性导管癌标本61例,免疫组化检测ER、PR、Her2、Ki67、P53、cyclin D1蛋白的表达情况。高分辨率多色FISH检测了33例伴有DCIS成分的浸润性导管癌石蜡切片CCND1和chk1基因拷贝数的改变。SPSS for Windows version 15.0软件对以上两部分试验结果进行数据分析。【结果】1、不同组织学分级(p＜0.0001)、肿瘤大小分组(p＜0.0001)、DNA倍体分组(p＜0.0001),Ki67和cyclin A表达均有统计学差异。在有无腋窝淋巴结转移分组,未发现Ki67和eyelin A表达有统计学差异。SPF值仅在不同DNA倍体分组有显著性统计学差异(p＜0.0001),在其他分组未见有统计学差异。2、Ki67和cyclin A阳性细胞百分数,以及SPF值两两相关。Ki67和cyclinA的相关系数是0.9,Ki67和SPF的相关系数是0.67,cyclin A和SPF的相关系数是0.68。3、与乳腺癌远处转移相关的Ki67和cyclin A阳性细胞百分数分界点(cut-off point)分别为15%和8%。增殖水平低的肿瘤,发生远处转移的百分率分别为6.8%(Ki67＜15%)和7.2%(cyclin A＜8%);而增殖水平高的肿瘤,发生远处转移的百分率分别为24.9%(Ki67≥15%)和27.9%(cyclin A≥8%)。两组比较有统计学差异(P＜0.001)。4、非整倍体肿瘤较二倍体肿瘤更易发生远处转移(P＜0.005),尤其是T1NO肿瘤,D-tumors的远处转移率是2-3%;A-tumors的远处转移率高达20-25%。在T2NO,T1N+和T2N+肿瘤中,两组间的转移率无统计学差异。5、对于肿瘤直径小于2cm且无腋窝淋巴结转移的肿瘤(T1NO肿瘤),不同增殖水平的D-tumors发生远处转移的几率小于4%;A-tumors发生远处转移的危险性视肿瘤细胞的增殖情况而定,增殖水平低的A-tumors与同组的D-tumors一样,发生远处转移的几率较低,但增殖水平高的A-tumors,远处转移的几率则接近30%,与前两组相比具有统计学差异(p＜0.001)。6、对于肿瘤直径大于等于2cm且无腋窝淋巴结转移的肿瘤(T2NO肿瘤)和肿瘤直径小于2cm但有腋窝淋巴结转移的肿瘤(T1N+肿瘤),无论DNA倍体如何,所有低增殖水平的的肿瘤发生远处转移的风险较T1NO肿瘤轻度增加(小于20%),高增殖水平的的肿瘤发生远处转移的风险明显增加(大于2l%)。7、对于肿瘤直径大于等于2cm且有腋窝淋巴结转移的肿瘤(T2N+肿瘤),无论肿瘤细胞的倍体和增殖水平如何,发生远处转移的几率均较高(25%—70%)。8、多因素Logistic回归分析显示,对于有腋窝淋巴结转移的乳腺癌患者,肿瘤细胞增殖水平高是判断是否发生远处转移的最主要危险因素(Ki67和cyclin A均p＜0.05);而对于无腋窝淋巴结转移的患者,肿瘤细胞非整倍体则是最主要的危险因素(p＜0.05)。9、cyclin A/Ki67比值高的肿瘤较比值低的肿瘤,远处转移率高,两组肿瘤转移率比较,有统计学差异(P＜0.05),尤其是在有腋窝淋巴结转移的患者,cyclin A/Ki67比值高的肿瘤更容易发生转移(P＜0.001)。10、Ki67或cyclin A高表达肿瘤较低表达肿瘤无复发和总的生存时间短,两者有统计学差异(P＜0.0001)。在Ki67(或cyclin A)低表达组,有14.9%(16.9%)的患者复发,14.3%(15.4%)的患者死亡;而在高表达组,复发率和死亡率分别为48.4%(39.3%)和34.6%(37.2%)。11、按组织学级别、肿瘤大小和腋窝淋巴结受累情况分组,在T1、T2、NO、N+、G2+3各组肿瘤中,Ki67或cyclin A高表达较低表达肿瘤无复发和总的生存时间短,两者比较有统计学差异。组织学Ⅰ级的肿瘤中,未发现上述统计学差异。12、182例浸润性导管癌COX回归分析显示,肿瘤细胞增殖水平是判断患者复发和死亡的独立的,最有意义的指标(Ki67,P=0.003;cyclin A,P=0.001)。13、428例乳腺癌中,85例在cyclin A细胞核表达的同时,出现细胞浆阳性表达,cyclin A细胞浆表达与肿瘤组织学级别高、增值水平高、非整倍体和cyclin A/Ki67比值高有关。14、61例乳腺癌中有53例出现Cyclin D1蛋白细胞核表达,表达率为86.9%。53例Cyclin D1阳性的病例中,11例同时伴有细胞浆Cyclin D1过表达。细胞浆Cyclin Dl表达与细胞核Cyclin D1阳性强和组织学分级高有关(P＜0.0001)。15、9例有CCND1扩增的病例中,7例有明显的细胞浆cyclin D1表达,而在24例无CCND1扩增的病例中,仅1例有细胞浆cyclin D1表达。CCND1扩增与细胞浆cyclin D1表达有统计学相关性(P＜0.0001)。16、9例有CCND1扩增的病例中,7例同时出现原位癌和浸润性癌区域的CCND1扩增。另外两例,仅在组织学分级Ⅲ级的浸润性导管癌区域有CCND1扩增,而在低级别的DCIS区域无CCND1扩增。cyclin D1在上述DCIS区域呈细胞核弱阳性表达,无胞浆表达;而在浸润性癌区域cyclin D1细胞核和细胞浆均呈强阳性表达。17、FISH结果显示,33例乳腺癌中10例有Chk1基因的杂合性缺失,8例Chk1缺失的乳腺癌患者同时出现CCND1基因的扩增。CCND1基因扩增和Chk1基因杂合性缺失有关联(P＜0.0001)。【结论】1、Ki67和cyclin A表达高度相关,两者的高表达与乳腺癌远处转移、复发和死亡早密切相关,两者对于判断乳腺癌患者预后具有同样的价值。2、乳腺癌发生远处转移的低危险组包括T1NO组的所有D～tumors和同组低增殖水平的A-tumors、T2NO和T1N+两组所有的低增殖水平肿瘤,低转移危险组肿瘤占所有肿瘤的40%,其发生远处转移的危险性小于6%。3、乳腺癌发生远处转移的高危险组包括所有T2N+肿瘤、除T1NO的D-tumors以外的所有高增值水平肿瘤,高转移危险组发生远处转移的危险性高达35%。4、cyclin A胞浆表达和cyclin A/Ki67比值高与乳腺癌恶性生物学行为有关。5、cyclin D1细胞核强阳性,同时伴有细胞浆表达提示有CCND1基因的扩增。6、cyclin D1过表达在乳腺癌发生早期即可出现,CCND1基因扩增与肿瘤侵袭有关。7、乳腺癌CCND1基因的扩增和chk1基因的缺失往往同时出现,两基因拷贝数的改变有关联。