辽宁新品系绒山羊新基因GMPR2生物学功能研究及K26抗体制备

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辽宁新品系绒山羊是我国特有的遗传资源,其山羊绒有着十分重要的经济价值。因此研究辽宁新品系绒山羊与经济性状相关基因的功能就显得尤为重要。本文旨在研究辽宁新品系绒山羊GMPR2新基因在皮肤中的功能及与绒毛生长的关系。首先对该基因进行了生物信息学分析,再利用地高辛标记的原位杂交技术对其进行定位研究,然后利用荧光定量技术对其进行相对定量分析,RT-PCR技术检测GMPR2基因是否在其它器官中表达,最后验证不同浓度、不同时间褪黑激素处理是否影响该基因的表达。实验证明:GMPR2可能间接调节初次级毛囊的生长萎缩。另外,因辽宁新品系绒山羊绒毛纤维的形成主要与微丝角蛋白(KIFs,K)的表达有关,为研究K26基因表达蛋白的表达量和表达位置,本实验构建BL21-pET32a-K26表达载体,提取重组蛋白后将其免疫到新西兰雄兔中,制作兔抗K26基因抗体,为后续研究工作奠定基础。重要结果如下:(1)经ORF Finder与Blast比对,确定得到的基因全长为GMPR2基因,其与牛GMPR2同源性最高。结构域分析显示,辽宁新品系绒山羊GMPR2含有一个与IMPDH相似的TIM管结构保守位点,该位点具有氧化还原活性,属于IMPDH/GMPR酶家族。(2)基因定位分析显示GMPR2基因在初、次级毛囊中都有表达,表达部位为初、次级毛囊的内根鞘。(3)基因定量分析显示GMPR2基因在退行期初级毛囊中的表达量约为次级毛囊的5.45倍,差异显著(P<0.01),在兴盛期与休止期表达量相差不明显;(4)另外,GMPR2基因只在皮肤中表达,在心、肝、肾、肺、脾内脏器官中未发现该基因表达;(5)用不同浓度(0.02g/L、0.2g/L、1g/L)、不同时间(24h、48h、72h)的褪黑激素处理辽宁新品系绒山羊兴盛期培养的皮肤细胞后,GMPR2基因的表达量都有明显的降低。其中,褪黑激素浓度为0.2g/L,处理48h,GMPR2基因的表达量降低最为明显(P<0.01)。(6)通过ELISA方法和Westen blot方法对抗体进行效价分析和特异性鉴定,结果表明效价达到1:32万以上,且特异性较好,说明制备的抗K26多克隆抗体成功。
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