脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，约占脑肿瘤60％，其恶性程度高、侵袭性强、病程短、致死率高。目前采取的手术切除、放疗和化疗等都无法达到预期治疗效果，综合治疗术后中位生存期仍不足一年。所以探索新的更为有效的治疗途径已成为胶质瘤治疗学中最为迫切的课题。　　 基因治疗被认为是一种很有前景的恶性胶质瘤治疗方法，这种治疗有赖于安全而有效的基因转染和表达系统。尽管目前许多病毒载体如逆转录病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒，因为它们的高转染效率而已用于胶质瘤的基因治疗中，但新的、具有更强靶向性且更高安全性的病毒载体依然有待于被研究与确立。甲病毒载体系统凭借着其宿主范围广、有效的外源生物合成、无插入突变危险等一系列优势，早已在基因治疗中占据了一席之地。近年来，关于甲病毒能特异性诱导肿瘤细胞凋亡研究的新成果，更突显其在胶质瘤等实体瘤的基因治疗中具有的重要性。然而，这种诱导凋亡的细胞及分子机制仍然不清楚。　　 本研究首次选取自中国分离的甲病毒M1,并在大鼠恶性胶质瘤细胞C6等多种恶性肿瘤细胞株及部分正常细胞株上来探讨M1对这些细胞存活的影响及其机制。　　 我们首次发现M1能有效地诱导C6的凋亡，而并不引起坏死；利用定量RT-PCR和western blot发现在M1诱导C6的凋亡模型中，伴随有抗凋亡蛋白Bcl-2的转录后水平的下调；激光扫描共聚焦显微镜和(或)细胞分级分离证实促凋亡蛋白Bax线粒体转位、线粒体膜电位降低、细胞色素C释放及caspase-3的活化；进一步研究发现Bax通道阻断剂能明显地保护M1诱导的C6凋亡，并且能显著地抑制细胞色素C的释放和caspase-3的活化，提示了Bax的线粒体转位和细胞色素C释放介导了M1诱导的C6凋亡：同时，我们发现caspase抑制剂Q-VD-OPh和蛋白酶体抑制剂MG132等能不同程度地保护M1所致的C6凋亡，并证实Q-VD-OPh抑制了caspase-3的激活，MG132阻断了Bcl-2的蛋白下调，提示caspase-3的激活以及Bcl-2的转录后下调介导了M1所致的C6凋亡。此外，研究发现M1对人恶性胶质瘤细胞T98G仅表现为增殖抑制效应，并不引起凋亡或坏死；进一步流式细胞仪分析T98G细胞周期阻滞在S期，主要表现为S期细胞比例增加，G2/M期细胞比例降低；另外通过激光扫描共聚焦显微镜证实在M1诱导的凋亡C6细胞中，细胞周期依赖性激酶-7(CDK7)从胞核转位至胞浆，与原复合体成员周期素H(cyclin H)分离，这为后续深入探讨增殖抑制的机制提供重要线索。最后，我们在多种肿瘤细胞(人恶性胶质瘤细胞U251和U87，人肝癌细胞Hep3B，人前列腺癌细胞LNCaP和人膀胱癌细胞T24)和部分正常细胞(原代胶质细胞和张氏肝细胞)的研究中首次初步证实M1能有效杀死这些肿瘤细胞，但对正常细胞没有影响，提示M1有一定的肿瘤杀伤谱特性及一定的肿瘤特异性。这为M1抗肿瘤的在体研究提供有力的实验依据和药理学基础，并为新病毒载体的开发及以甲病毒载体为基础的肿瘤基因治疗提供新的思路。　　 第一章甲病毒M1诱导大鼠恶性胶质瘤细胞C6的凋亡　　 第1节凋亡模型的建立　　 方法:大鼠胶质瘤C6细胞株培养；相差显微镜术观察细胞形态；MTT法测定细胞增殖能力；LDH法测定细胞毒性；Hoechst33258核染色、DNA琼脂糖凝胶电泳分析细胞凋亡；流式细胞仪AnnexinV-FITC/PI染色测定细胞凋亡率；透射电镜观察病毒颗粒及细胞凋亡；间接免疫荧光结合激光扫描共聚焦显微术分析蛋白的表达。　　 结果:相差显微镜显示M1感染的细胞突起断裂，胞体透亮、变圆变小；MTT测定显示从感染后36h开始细胞出现增殖抑制，到48h时即明显抑制；LDH测定显示感染60h前细胞没有毒性，仅在感染60h时才出现轻微毒性；Hoechst染色呈现典型的核固缩或凋亡小体，DNA琼脂糖凝胶电泳显示典型的梯状条带，AnnexinV-FITC/PI染色显示明显的凋亡，Annexin V-FITC单纯阳性的凋亡细胞比例从感染后24h的5.5％明显地增加至感染后60h的48.3％；透射电镜显示细胞内的病毒颗粒及典型的新月状偏集的凋亡染色质；共聚焦显微镜检测出剪切的caspase-3和Lamin A(核纤层蛋白)。　　 结论: M1明显诱导大鼠胶质瘤细胞C6的凋亡，表现为经典的凋亡特征，并呈时间依赖性，而不引起细胞坏死。此外，M1诱导了内源性caspase-3的激活。　　 第2节 Bax转位和cytochrome C释放介导了M1诱导的C6凋亡　　 方法:大鼠胶质瘤C6细胞株培养；相差显微镜术观察细胞形态：MTT法测定细胞增殖能力；Hoechst33258核染色观察细胞凋亡并测定细胞凋亡率；细胞线粒体组分及胞浆组分的分离；Western blot分析蛋白的表达变化；流式细胞仪JC-1法分析线粒体膜电位改变；间接免疫荧光结合激光扫描共聚焦显微术分析蛋白的空间变化。　　 结果:在C6凋亡中，Bax蛋白表达没变化，但Bax从胞浆转位到线粒体；线粒体膜电位下降，细胞色素C释放到胞浆；Bax通道阻断剂(10uM)能明显保护M1所致的凋亡，并抑制线粒体cytochrome c的释放、caspase-3的剪切；caspase抑制剂Q-VD-OPh可较明显阻断M1诱导的凋亡，并抑制caspase-3的激活。　　 结论: Bax转位、cytochrome C释放以及caspase-3的激活参与了M1诱导的C6凋亡，表现为线粒体通路的部分依赖性。　　 第3节 Bcl-2的转录后下调参与了M1诱导的C6凋亡　　 方法:大鼠C6细胞株培养；相差显微镜术观察细胞形态：MTT法测定细胞增殖能力；Hoechst33258核染色观察细胞凋亡并测定细胞凋亡率；Western blot分析蛋白的表达变化；Real-time RT-PCR分析mRNA的表达变化。　　 结果:在C6凋亡中，Bcl-2蛋白表达呈时间依赖性地降低，而mRNA水平明显增加；同时发现蛋白酶体抑制剂MG132(200nM)，钙蛋白酶抑制剂MDL28170(25uM)，蛋白磷酸酶抑制剂cantharidin(40nM)能不同程度地保护Ml所致C6的凋亡；并证实MG132能明显阻断Ml所致Bcl-2蛋白的下调。　　 结论: Bcl-2的转录后下调可能参与了Ml诱导的C6凋亡。　　 第二章 M1诱导人恶性胶质瘤细胞T98G的增殖抑制　　 方法:人胶质瘤T98G细胞株培养；相差显微镜术观察细胞形态；MTT法测定细胞增殖能力；Hoechst33258核染色观察细胞凋亡；LDH法测定细胞毒性；流式细胞术检测细胞周期；间接免疫荧光结合激光扫描共聚焦显微术分析蛋白的空间变化。　　 结果: MTT测定显示从感染36h开始，病毒对T98G细胞的增殖开始有抑制作用，此后时间点增殖抑制更明显，实验组与对照组比较均有统计学意义(P<0.05)；Hoechst染色感染组未显示固缩核和凋亡小体征象；LDH释放测定显示感染组与对照组无统计学差异；流式细胞仪周期分析显示在M1感染后，T98G细胞阻滞于S期，具有时间依赖性，主要表现为S期细胞比例增加和G2/M期比例降低；共聚焦显微镜荧光共定位分析，随着感染时间的延长，CDK7在核中开始弥散性分布，到48h时，在细胞中可见CDK7出核，形成明显的环形围绕核周分布；而MAT1及cylin H随着时间延长，与对照组相比，未见空间转位变化。　　 结论: M1对T98G细胞仅表现为增殖抑制效应，而不引起凋亡或坏死，并伴随有细胞周期S期阻滞和细胞周期依赖性激酶7(CDK7)的核浆转位。这种转位为后续深入研究增殖抑制机制提供线索。　　 第三章 M1对肿瘤细胞特异性杀伤的初步研究　　 方法:大鼠胶质瘤C6，人胶质瘤U251,U87，人肝癌Hep3B，人前列腺癌LNCaP，人膀胱癌T24细胞株及原代胶质细胞和张氏肝细胞株培养；相差显微镜术观察细胞形态；MTT法测定细胞增殖能力；FDA结合PI染色分析细胞存活率；流式细胞术检测细胞周期。　　 结果:相差FDA-PI显示M1可诱导胶质瘤细胞株C6，U87，U251死亡(PI红色着染)，但对正常胶质细胞没有影响；可诱导人肝癌细胞株Hep3B的死亡，但对正常肝细胞没有影响；M1也可诱导人前列腺癌细胞株LNCaP和人膀胱癌细胞株T24的死亡。MTT测定显示M1能不同程度抑制上述恶性肿瘤细胞的增殖抑制，但对相应的正常细胞无抑制效应。　　 结论: M1可诱导胶质瘤细胞株C6，U87，U251及肝癌细胞株Hep3B的增殖抑制和死亡：能诱导人前列腺癌细胞株LNCaP和人膀胱癌细胞株T24的死亡。但对正常的胶质细胞和肝细胞无或极少影响。提示M1有一定的肿瘤杀伤谱特性及一定的肿瘤特异性。