背景：干细胞治疗急性心肌梗死是近年来研究的热点。脂肪来源的间充质干细胞(adipose tissue-derived mesenchymal stem cclls，ADMSCs)作为一种新的细胞工程的种子细胞因为取材方便、来源充足、更易被人们所接受等优点逐渐被大家接受。但目前国内、外对于ADMSCs的研究还处于起步阶段，与骨髓来源干细胞研究相比，其治疗相关机制的基础研究还很有限，在临床应用前尚有许多问题有待解决。比如ADMSCs是否可以分化为真正的具有兴奋、收缩和传导功能的心肌细胞，如何提高AMDSCs向肌细胞的分化率等。这些问题的解决对于指导ADMSCs在临床的应用具有十分重要的意义。目的：一是要建立从Wistar大鼠脂肪组织大量分离、培养ADMSCs方法，并观察在体外培养扩增、长期保存、外源目的基因的导入情况，确定其是否可以作为一个合适的工具细胞，为后续研究做准备。二是观察比较不同体外向心肌细胞定向诱导分化的方法，探索最佳的体外诱导策略。三是观察诱导前后的ADMSCs兴奋性和传导性的变化。内容和方法：根据以上目的，本研究分成为三个部分：第一部分研究Wistar大鼠ADMSCs的分离及体外培养、保存；并通过对获取的细胞进行细胞表面间充质干细胞相关标志及多向分化潜能的检验来验证其是否为间充质干细胞；用携带绿色荧光蛋白和肝细胞生长因子的人Ⅴ型腺病毒感染AMDSCs以观察其是否可以作为有效的基因载体。第二部分对第一部分获取的第3代ADMSCs分别采用5-氮胞苷、心肌细胞提取物、5-aza和心肌细胞提取物混合诱导的方法向心肌细胞定向诱导分化。诱导4～6周后应用RT-PCR技术、免疫组化法、透视电镜技术对诱导后的ADMSCs从基因水平、蛋白水平和超微结构多个方面进行鉴定，并用流式细胞计数的方法比较各诱导方法α-actin阳性细胞比率，以找到最有效的诱导方法，同时还观察ADMSCs(用DAPI荧光标记)与乳鼠心肌细胞混合培养的状况。第三部分用多电极阵列系统(multi-channel array system，MEA)测定诱导前、后ADMSCs兴奋性和传导性的变化。分别测定了第2代乳鼠心肌细胞、未经诱导的第3代ADMSCs、经混合诱导的第3代ADMSCs、诱导ADMSCs与乳鼠心肌细胞的共培养模型。结果：从Wistar大鼠脂肪组织分离培养出大量螺旋生长的长梭形细胞。这些细胞的细胞表面分子CD13、CD44、CD105皆阳性，CD34、CD45、Ⅷ因子、HLA-DR、VWF均阴性；具有成骨、成脂、成肌的多向分化能力。可以在体外连续传代培养而保持稳定的生长速度，第3至8代细胞倍增时间为55至63小时；经2至4周液氮冷冻保存后复苏存活率90％以上，细胞表面阳性标志保持不变；可以用人Ⅴ型腺病毒转染目的基因GFP和HGF并大量表达目的基因相关的蛋白，但感染后的细胞很快死亡。在体外用5-氮杂胞苷，心肌细胞提取物、5-aza和心肌细胞提取物混合诱导的方法均可成功诱导Wistar大鼠的ADMSCs向心肌细胞定向分化，分化率分别为18.58％，58.67％，62.27％。研究证明诱导后可以使与心肌细胞发育相关基因GATA-4、Nkx2.5及MyoD启动，并表达α-actin、间隙连接蛋白CX43和CX45；透视电镜下可见到肌丝样结构。但诱导后未发现有自发跳动的细胞。与乳鼠心肌细胞混合培养的ADMSCs在混合培养后分裂增殖减弱，可并随乳鼠心肌细胞群一同收缩运动。对于诱导前、后的ADMSCs，多电极阵列系统检测均未发现有自发电活动信号。但诱导前、后ADMSCs对外源电刺激的细胞膜反应不同：未诱导的ADMSCs对电刺激反应弱；而诱导后的ADMSCs对外源性电刺激反应明显，记录到了较明显的类似心肌动作电作的细胞膜电位变化，但这种电位变化也不能有效传导；ADMSCs与乳鼠心肌细胞的共培养模型中可以在心肌细胞覆盖的电极区记录到心肌细胞自发兴奋信号，心肌细胞周围ADMSCs覆盖的电极未记录到相应的电信号。结论：1．通过酶消化的方法成功地从Wistar大鼠脂肪组织分离培养出具有多向分化潜能的ADMSCs。分离的ADMSCs具有旁分泌功能，易于在体外长期传代培养、大量扩增、长期冻存，并能成功导入外源基因。这些特征证明了ADMSCs作为细胞和基因工程备选种子细胞的基础，也为ADMSCs进一步的实验研究提供了一个理想的工具细胞。2．在体外可以用多种方法成功诱导Wistar大鼠的ADMSCs分化成为心肌样细胞，其中用5-aza和乳鼠心肌细胞裂解液混合诱导的分化率最高。3．诱导后的ADMSCs的兴奋性增强，但传导性很差，表现为明显的延迟和衰减。