虎纹捕鸟蛛(Ornithoctonus huwena)是分布在我国广西、云南以及越南等东南亚国家原始森林中的大型捕鸟蛛。它的毒液是由许多生物活性成份组成的复杂混合物,通过蛋白质组学和多肽组学方法从粗毒中已经鉴定了90种蛋白质和47种多肽,但这仅仅为粗毒中的部分高丰度组份。本试验室前期工作中采用蛋白质组学与多肽组学方法,结合转录组的数据,根据前体肽序列的差异,将HWTX-Ⅺ和HWTX-ⅩⅢ以外的成份,分成HWTX-Ⅰ、HWTX-Ⅱ、HWTX-Ⅹ、 HWTX-ⅩⅣ、HWTX-ⅩⅤ、 HWTX-ⅩⅥ HWTX-ⅩⅦ和HWTX-ⅩⅧ等8个超家族。这些多肽中含有丰富半胱氨酸残基,因此命名为半胱氨酸结毒素(CKT)。其中,HWTX-ⅩⅧa1作为HWTX-ⅩⅧ超家族一员,由64个氨基酸残基组成,含四对二硫键,pI为7.72/Mv,平均分子质量为6433.29 Da。这个多肽在粗毒蛋白质组和转录组中均被鉴定到。然而,由于丰度很低,无法从粗毒纯化中获得足够的样品进行功能研究。而且,其氨基酸数目较多,进行多肽化学合成困难。在实验室前期的工作中,利用酵母表达系统也未获得成功。因此,我们拟采用大肠杆菌原核表达融合蛋白再进行切割、纯化并复性的方法获得HWTX-ⅩⅧa1。我们采用的载体是pET-32a (+),菌株为E. coli BL21-RIPL。首先是将带有目标基因的pET-32a(+)表达质粒转入进E. coli BL21-RIPL感受态中进行诱导表达。当诱导剂(IPTG)浓度在0.6-0.8 mM时,该融合蛋白有最高的表达量；然后裂解菌液。融合蛋白中含有6×His标签,用Ni-NTA珠进行纯化获取融合蛋白。考虑到融合蛋白需要切割,我们曾设计两类方案：第一种方案是在标签蛋白与目标蛋白间引入因子Xa蛋白酶酶切位点(Ile-Glu-Gly-Arg↓):具体操作时应用两个不同策略：1.在标签蛋白与目标基因直接引入酶切位点；2.在酶切位点前段引入一段柔肽序列(Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly)。结果表明,在未引入柔肽时,重组蛋白在酶切所选的低盐溶液中的溶解度降低,容易聚合,酶切效率不高,获得的目标肽的量很少；引入柔肽后,重组多肽更易被酶切割,酶切效率提高。第二种方案是在标签蛋白与目标蛋白间引入甲酸切割位点(Asp↓Pro)。甲酸切割的成本较低,甲酸切割后X残基会残留在目标肽的N端。我们的实验发现,甲酸切割后的条带很杂,对目标肽的纯化是一个考验。根据上述结果,我们选择引入柔肽结合因子Xa蛋白酶酶切这一方案获得不带标签的目的肽。酶切产物上样至16%的Tricine-SDS凝胶电泳图谱清晰的显示未酶切带标签的重组肽、目的肽及标签蛋白的条带。为了有效去除未切割的重组肽与标签蛋白,我们采用了Ni-NTA琼脂糖珠回收带6×His标签蛋白的方式,结果显示这种方式去除6×His标签蛋白不完全,而且对目的肽也有非特异性吸附。之后,我们采取离子交换层析结合Tricine-SDS凝胶电泳鉴定的方法,对酶切产物进行初步纯化。电泳结果显示,10 KDa与3.5 KDa之间的肽片段(应包含我们的目的肽)在pH 5.8的磷酸缓冲液中流穿SP强阳离子交换柱。进一步的MALDI-TOF质谱结果鉴定到分子量与理论HWTX-Ⅷa1一致的6433.1Da的峰,表明流出液中含有目的肽。由于酶切后的大部分成份均保留在柱子上,我们采用这种方式对酶切产物实现粗分离,这一步,可以去除大部分10 KDa以上的酶切产物,但10 KDa以下的多肽中,除目的肽以外,还有一个分子量为5007 Da的分子,提示进一步的分离纯化是有必要的。我们先后尝试用RP-HPLC C18柱与C4柱对含目的肽的SP强阳离子交换柱流出液进行分析,但没有洗脱峰。显示未折叠状态下的目的肽与天然肽的差异。本文的数据为获得出足够量HWTX-ⅩⅧa1目标肽进行复性实验乃至功能研究,建立坚实的基础,同时也为实验室进行较大毒素分子的表达和功能研究提供新思路。