基于小胶质细胞NLRP3炎症小体研究芍药苷对帕金森病抑郁的治疗作用

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帕金森病(Parkinson Disease,PD),是中老年常见的慢性神经退行性疾病,其中抑郁是PD最常见的非运动症状,大量临床研究表明帕金森病伴发抑郁(Parkinson Disease Depression,PDD)的发病率超过50%。芍药苷(paeoniflorin,Pae)是从芍药的根中提取出来,具有抗炎,抗氧化和增强记忆的作用。目前芍药苷在帕金森病抑郁发生发展过程中的作用及机制尚不清楚。目的:研究阐明芍药苷通过抑制小胶质细胞NLRP3炎症小体介导的神经炎症治疗帕金森病抑郁。方法:1.C57/b6J成年雄性小鼠55只,随机分为空白组((Con,10只)、1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)亚急性模型组(MPTP,35只)、单给芍药苷组(Pae,10只)。空白组不予任何刺激,Pae组每日Pae(30 mg/kg×7d)灌胃,MPTP亚急性模型组腹腔注射MPTP(30mg/kg×7d),7d后通过强迫游泳(Forced swim test,FST)挑选抑郁样小鼠63.3%,选出10只小鼠灌胃Pae(30 mg/kg×7 d),等量生理盐水作为对照,末次给药1天后,通过糖水偏爱(Sucrose preference test,SPT)、FST和悬尾实验(Tailsuspensiontest,TST)检测小鼠抑郁样行为;应用蛋白免疫印迹(Western-B lotting)法,检测腹内侧前额叶皮层区(Ventromedial prefrontal cortex,mPFC)突触蛋白:突触后密度蛋白95(Postsynaptic density-95,PSD-95)、突触蛋白(synapsin-1,SYN1)、谷氨酸受体1(GluR1)的表达及中脑腹侧被盖区(Ventral tegmental area,VTA)小胶质细胞标记物离子钙接头蛋白(Iba-1)和炎症小体亚基含有NACHT,LRR 和PYD 结构域蛋白质 3(NACHT,LRR and PYD domains-containing protein3,NLRP3),人半胱氨酸蛋白酶-1(Cysteiny1aspartate specific Proteinase-1,Caspase-1),凋亡相关斑点样蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein,ASC)的表达;应用免疫组织化学方法观察VTA区多巴胺能神经元形态变化;应用酶联免疫吸附测定(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)试剂盒,检测 VTA 区炎症因子干扰素 1β(Interleukin 1β,IL-1β),肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α),干扰素6(Interleukin 6,IL-6)含量变化。2.应用1-甲基-4-苯基吡啶(1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP+)建立N2a细胞模型,实验分为4组:正常组,模型组,模型组+芍药苷组,芍药苷组。应用CCK8试剂盒检测实验各组细胞存活率;应用BV-2细胞制备LPS+ATP/MPP++ATP炎症小体模型,实验分为4组:正常组,模型组,模型组+芍药苷组,芍药苷组。应用CCK8检测小胶质细胞凋亡,应用ELISA检测细胞上清液IL-1β,TNF-α,IL-6的含量变化,应用Western-Blotting测定细胞上清液炎症小体相关蛋白变化,应用激光共聚焦显微镜观察小胶质细胞的形态变化以及NLRP3,Caspase-1的分布。结果:1.在体水平实验结果显示芍药苷能够逆转MPTP所致小鼠FST和TST不动时间的延长及糖水偏爱率的降低。MPTP造模和芍药苷给药对小鼠在OFT中的行为无显著影响。并且芍药苷能够逆转MPTP诱导的PDD模型小鼠mPFC区突触蛋白PSD-95,synapsin-1,GluR1含量的降低。进一步发现,MPTP造模后,小鼠VTA区DA神经元减少,为对照组的78%,而小胶质细胞显著增殖活化,芍药苷能够改善PDD模型小鼠VTA区DA神经元的损伤,并抑制小胶质细胞的过度激活。最后,Western blotting检测结果显示,芍药苷可以抑制PDD模型小鼠VTA区NLRP3,ASC,Caspase-1的表达增加。2.离体水平实验结果显示,10μMMPP+对N2a细胞无显著影响,50,100,250,500,1000,2000μM MPP+浓度依赖性损伤N2a细胞,其中MPP+浓度达到250μM时,细胞存活率为71.1%,芍药苷(1,5,25,50,100μM)均能够提高N2a细胞的存活率。LPS+ATP/MPP++ATP模型下,BV-2细胞存活率均降低,而芍药苷显著抑制炎症小体激活所导致的BV-2细胞死亡。进一步发现,LPS+ATP/MPP++ATP模型下,BV-2分泌IL-1β,TNF-α和IL-6均显著增加,芍药苷仅抑制IL-1β的分泌,对于TNF-α和IL-6的分泌无影响。并且,芍药苷抑制LPS+ATP/MPP++ATP诱导的BV-2细胞增殖活化,并减少胞浆内NLRP3和Caspase-1的表达。最后,芍药苷能够抑制LPS+ATP/MPP++ATP诱导BV-2细胞Caspase-1的激活以及IL-1β成熟与分泌。结论:1.PDD模型小鼠中,芍药苷通过抑制VTA区小胶质细胞介导的神经炎症,从而保护DA神经元,发挥抗抑郁的作用。2.芍药苷靶向抑制NLRP3炎症小体介导的IL-1β分泌,抑制小胶质细胞的增殖活化,发挥抗炎作用。
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