目的5-氨基酮戊酸联合IPL光动力疗法(5-ALA-IPL-PDT)是近年用于皮肤老化治疗的一种方法。现有的临床研究显示IPL光动力疗法较单纯采用IPL照射,在改善皮肤老化的症状方面更具疗效。但其中涉及的机制并不十分清楚。本实验首先观察IPL对小鼠皮肤胶原合成的影响,以及对体外培养成纤维细胞增殖、胶原分泌表型的影响。为后续研究摸索实验条件并观察功能学变化。MAPK是调控细胞增殖、分化和存活等功能的信号网络中心。为了研究IPL诱导的增殖与MAPK之间的关系,我们观察不同剂量IPL辐照对体外培养成纤维细胞胞内MAPK家族成员ERK、P38、JNK活性影响,以及信号蛋白活性的时相性变化。转化生长因子(TGF-β1)是细胞外基质蛋白合成的主要刺激因子,而MMP-1是促进细胞外基质蛋白降解的主要活性蛋白。两者都可由成纤维细胞分泌,但两者的功能相反。我们试图观察IPL如何影响两者的分泌,以及其与细胞外基质合成之间的关系。细胞因子(如：MMP-1、TGF-β1)在IPL嫩肤治疗中扮演重要的角色。然而细胞因子的分泌是首要胞内信号通路的严格调控,本部分研究着重评价MAPK家族成员(ERK、P38、JNK)介导的信号通路对IPL诱导相关分泌表型的变化的影响和机制。在上述前期研究基础上,观察5-氨基酮戊酸联合IPL光动力疗法(5-ALA-IPL-PDT)对成纤维细胞MMP-1、TGF-β1分泌影响。同时探究上述细胞因子分泌表型变化的信号机制,着重研究MAPK家族成员(ERK、P38、JNK)介导的信号通路在5-ALA-IPL-PDT治疗皮肤老化中的作用机制。方法在活体实验中,给予褪毛小鼠梯度能量密度的IPL辐照,在不同时间点(1,3,7,14和28天)收集小鼠皮肤标本,免疫组织化学方法检测皮肤胶原蛋白的改变和成纤维细胞增殖。同时给予体外培养的成纤维细胞梯度能量密度的IPL辐照,在不同时间点收集细胞,流式细胞法检测细胞周期改变；MTT法确细胞增殖变化；免疫组织化学法检测胶原蛋白的变化。将成纤维细胞接种在12孔板中,给予梯度剂量(0、10、18、36和72J/cm2)的IPL辐射,在辐照后不同时间点收集提取细胞全蛋白,Western blot法检测ERK、P38和JNK磷酸化水平的变化。人皮肤成纤维细胞接种培养至12孔培养板,随后分别给予0、10、18、36和72J/cm2的梯度剂量IPL辐射,在辐照后24h收集上清,ELISA法检测TGF-β1、 MMP-1水平的变化。在干预研究中,预先采用PD98059、SB203580和SP600125处理成纤维细胞,分别阻断ERK、P38、JNK信号通路。收集成纤维细胞,随后给予IPL辐照。免疫印迹法观察这些家族成员信号的变化水平。在照射后24小时收集上清,酶联免疫吸附试验法检测TGF-β,MMP-1水平的变化。成纤维细胞接种至培养板。在IPL辐照前,预先采用ALA处理细胞2小时,随后给予成纤维细胞IPL辐照。MTT法检测光动力疗法的细胞毒作用,预设合适光动力参数。免疫印迹法观察这些家族成员信号的变化水平。在照射后24小时收集上清,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测TGF-β1、MMP-1水平的变化。实验分组为：空白组、IPL照射组、IPL(10J)+ALA(0.5mM).IPL(10J)+ALA(1.0mM)。结果1)给予小鼠32J/CM2的IPL辐照仅轻度增加真皮层的厚度,但真皮胶原纤维的致密性增强。表皮层改变未见显著改变。IPL照射可促进PCNA(增殖细胞核抗原)的表达。低剂量IPL辐照体外培养的成纤维细胞并不能明显促进细胞的增殖。2)实验发现与无IPL处理组比较,10J/cm2IPL辐照可轻度激活三者的磷酸化,18-72J/cm2IPL辐照可剂量依赖性的抑制ERT、P38和JNK磷酸化,72J/cm2IPL辐照可最强的抑制这些信号的活化；时间组可观察到,在照光后1小时ERT、P38、JNK磷酸化水平达到峰值,随后三者磷酸化水平降至基础值之下。0-36J的IPL辐照对TGF-β1的分泌没有明显的促进作用,当剂量达到72J/cm2时可观察到TGF-β1的分泌明显增加。IPL同时影响MMP1的分泌,与空白组比较,仅在10J剂量时可观察到MMP1分泌轻度增加,而18-72J/cm2的辐照对其分泌均未见明显的影响。3)PD98059、SP600125预处理可显著抑制成纤维细胞的ERK和JNK磷酸化,SB203580预处理未明显改变P38磷酸化水平；2)与对照组比较,SP600125可明显增强MMP-1的水平,平均增高254%。而PD98059、SB203580对MMP1的分泌无显著影响；3)SB203580组可观察到最明显的TGF-β1分泌,分别为对照组、PD98059组和SP600125组的329.27%、567%和358%(P<0.05)。4)高于18J IPL照射,联合ALA浓度高于(0.5mmM)预处理可产生显著的细胞毒效应；据此我们后续实验光动力参数设为：IPL照剂量10J, ALA浓度为0.5-1.0mM。与空白组比较,IPL(10J)+ALA(0.5mM)组、IPL (10J)+ALA(1.0mM)组,MMP-1浓度分别增加94.7%和111.4%,而TGF-β1浓度分别降低34.8%和39.1%; IPL (10J)+ALA(0.5mM)组可观察到最明显的MAPK家族信号分子活性的增强,灰度分析显示：与IPL组比较,ERK、P38和JNK分别增加113.1%、36.1%和67.3%(P<0.05)。结论本研究显示IPL辐照可促进体内外成纤维细胞分泌胶原蛋白,这一模型的建立为研究IPL嫩肤机制提供了功能学依据。通过观察IPL对成纤维细胞增殖、凋亡、存活生理学水平的研究,从多个角度探讨IPL嫩肤的潜在信号分子机理。高剂量的IPL辐照可下调体外培养成纤维细胞内MAPK信号蛋白活性。后者对细胞增殖和分泌表型产生何种影响需要进一步研究。IPL辐照对TGF-β1、MMP1分泌的影响具有双向性,高剂量(72J/cm2)辐照可促进TGF-β1的分泌,较低剂量(10J/cm2)促进MMP-1的分泌。以上研究为IPL促进成纤维细胞增殖机理和分泌表型的变化提供了新的实验证据。IPL介导的MMP和TGF的分泌表型变化中,MAPK家族成员发挥着不同的作用。P38是TGF-β1分泌的负性调节因子；而JNK起上调作用；ERK对TGF-β1分泌无影响。JNK可增加MMP-1的表达,而ERK和P38对MMP-1分泌无显著影响。综合以上部分的研究,我们研究显示IPL可通过改变MAPK活性影响MMP-1和TGF-β1的分泌。除此之外潜在的替代途径也发挥着作用。5-ALA-IPL-PDT光动力疗法是对成纤维细胞是一种应激反应,强烈的应激反应可产生细胞毒效应。在亚细胞毒剂量范围内,IPL联合光动力疗法显著改变成纤维细胞的分泌表型和信号通路的活化模式。该疗法总体上刺激MAPK家族分子(ERK、P38、INK)的活化,其中以ERK的活化最为显著。5-ALA-IPL-PDT光动力疗法可诱导成纤维细胞MMP1的分泌,而抑制TGF-β1的分泌。