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课题组前期研究证实，肿瘤细胞释放的自噬小体（TRAPs）不仅能诱导B细胞成为IL-10+Breg型，而且能诱导巨噬细胞成为PD-L1high IL-10+M2型，是肿瘤微环境抑制性免疫细胞形成的新机制。
肿瘤相关中性粒细胞（TAN）可分泌细胞因子，直接影响肿瘤微环境免疫细胞功能以及肿瘤细胞转移。前期实验发现：肿瘤细胞释放自噬小体（TRAPs）能诱导中性粒细胞分泌ROS，抑制CD8+T细胞和CD4+ T细胞的增殖活性及分泌IFN-γ 水平。本研究拟进一步探讨 TRAPs 对中性粒细胞表达趋化因子的影响及其对免疫细胞的趋化作用。
目的：
探讨TRAPs对人中性粒细胞趋化因子表达的影响及相应机制和功能，为理解TRAPs诱导中性粒细胞在肿瘤微环境中的作用机制提供实验依据。
方法：
1. 采用密度梯度离心法获取人外周血中性粒细胞并用流式细胞术检测其纯度；采用磁珠分选法分离小鼠的骨髓中性粒细胞；通过差速离心法募集 B16F10、MDA-MB-231肿瘤细胞培养上清中的TRAPs并用Western blot法和流式细胞术鉴定其纯度。
2. 小鼠中性粒细胞与B16F10细胞来源 TRAPs（B16F10-TRAPs）共孵育，RNA sequence检测TRAPs处理小鼠中性粒细胞前后趋化因子表达；人中性粒细胞与MDA-MB-231细胞来源TRAPs（MDA-TRAPs）共孵育，QRT-PCR法检测TRAPs处理人中性粒细胞前后CCL2、CCL3、CCL4、CXCL1和CXCL16的表达情况；将不同浓度的 MDA-TRAPs 与人中性粒细胞共孵育不同时间，采用QRT-PCR、ELISA法检测CCL3水平。
3. 将MDA-TRAPs与人中性粒细胞共孵育0、15、30、60、120分钟，用Western Blot 法检测不同时间点 p65、p-p65、IKBα、p-IKBα、IKKα/β、p-IKKα/β 及GAPDH蛋白的表达；将人中性粒细胞分别用NF-κB、p38和Stat3抑制剂预处理1小时，再与MDA-TRAPs共孵育，分别用QRT-PCR、ELISA法检测抑制剂处理前后CCL3的水平。
4. 将10 μg/mL 的MDA-TRAPs与人中性粒细胞共孵育，获得细胞培养上清，用Transwell实验检测经过/未经TRAPs处理的人中性粒细胞培养上清对THP-1 细胞的趋化; 在 TRAPs 处理的人中性粒细胞培养上清中，分别加入 CCL3封闭抗体、同型对照抗体进行封闭，用 Transwell 实验检测不同培养上清对THP-1细胞的趋化；再用Transwell实验检测经过/未经TRAPs处理的人中性粒细胞培养上清对人中性粒细胞和PBMC的趋化。
结果：
1. 密度梯度离心法可以从人外周血中获得纯度高达98.9%的人中性粒细胞；差速离心法可从MDA-MB-231细胞的培养上清中提取出纯度达90.7%、LC3阳性的自噬小体。
2. TRAPs处理小鼠中性粒细胞后，上调表达14种趋化因子，包括CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CXCL1和CXCL16等；下调表达8种趋化因子，包括CCL6、CCL9等。TRAPs处理人中性粒细胞后，CCL3、CCL4、CXCL1和CXCL16在 mRNA水平上调，其中CCL3上调幅度最大，但是CCL2的mRNA表达变化没有统计学意义；在mRNA和蛋白水平上，人中性粒细胞表达CCL3随TRAPs浓度的增加而逐渐增加，并且随孵育时间的延长而逐渐增加。
3. TRAPs 诱导人中性粒细胞 NF-κB 信号通路发生明显磷酸化；TRAPs 诱导的NF-κB抑制剂预处理的人中性粒细胞CCL3 mRNA表达及蛋白含量都显著减少，而p38和Stat3抑制剂预处理的人中性粒细胞CCL3表达无明显变化。
4. TRAPs 诱导的人中性粒细胞能够促进 THP-1 细胞的趋化；而用 CCL3 封闭抗体进行封闭后，趋化的THP-1细胞数量显著减少。另外，TRAPs诱导的人中性粒细胞能够促进人中性粒细胞、PBMC的趋化。
结论：
1. TRAPs通过NF-κB信号通路上调人中性粒细胞CCL3的表达；
2. TRAPs促进人中性粒细胞对THP-1细胞、中性粒细胞和PBMC的趋化作用。
肿瘤相关中性粒细胞（TAN）可分泌细胞因子，直接影响肿瘤微环境免疫细胞功能以及肿瘤细胞转移。前期实验发现：肿瘤细胞释放自噬小体（TRAPs）能诱导中性粒细胞分泌ROS，抑制CD8+T细胞和CD4+ T细胞的增殖活性及分泌IFN-γ 水平。本研究拟进一步探讨 TRAPs 对中性粒细胞表达趋化因子的影响及其对免疫细胞的趋化作用。
目的：
探讨TRAPs对人中性粒细胞趋化因子表达的影响及相应机制和功能，为理解TRAPs诱导中性粒细胞在肿瘤微环境中的作用机制提供实验依据。
方法：
1. 采用密度梯度离心法获取人外周血中性粒细胞并用流式细胞术检测其纯度；采用磁珠分选法分离小鼠的骨髓中性粒细胞；通过差速离心法募集 B16F10、MDA-MB-231肿瘤细胞培养上清中的TRAPs并用Western blot法和流式细胞术鉴定其纯度。
2. 小鼠中性粒细胞与B16F10细胞来源 TRAPs（B16F10-TRAPs）共孵育，RNA sequence检测TRAPs处理小鼠中性粒细胞前后趋化因子表达；人中性粒细胞与MDA-MB-231细胞来源TRAPs（MDA-TRAPs）共孵育，QRT-PCR法检测TRAPs处理人中性粒细胞前后CCL2、CCL3、CCL4、CXCL1和CXCL16的表达情况；将不同浓度的 MDA-TRAPs 与人中性粒细胞共孵育不同时间，采用QRT-PCR、ELISA法检测CCL3水平。
3. 将MDA-TRAPs与人中性粒细胞共孵育0、15、30、60、120分钟，用Western Blot 法检测不同时间点 p65、p-p65、IKBα、p-IKBα、IKKα/β、p-IKKα/β 及GAPDH蛋白的表达；将人中性粒细胞分别用NF-κB、p38和Stat3抑制剂预处理1小时，再与MDA-TRAPs共孵育，分别用QRT-PCR、ELISA法检测抑制剂处理前后CCL3的水平。
4. 将10 μg/mL 的MDA-TRAPs与人中性粒细胞共孵育，获得细胞培养上清，用Transwell实验检测经过/未经TRAPs处理的人中性粒细胞培养上清对THP-1 细胞的趋化; 在 TRAPs 处理的人中性粒细胞培养上清中，分别加入 CCL3封闭抗体、同型对照抗体进行封闭，用 Transwell 实验检测不同培养上清对THP-1细胞的趋化；再用Transwell实验检测经过/未经TRAPs处理的人中性粒细胞培养上清对人中性粒细胞和PBMC的趋化。
结果：
1. 密度梯度离心法可以从人外周血中获得纯度高达98.9%的人中性粒细胞；差速离心法可从MDA-MB-231细胞的培养上清中提取出纯度达90.7%、LC3阳性的自噬小体。
2. TRAPs处理小鼠中性粒细胞后，上调表达14种趋化因子，包括CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CXCL1和CXCL16等；下调表达8种趋化因子，包括CCL6、CCL9等。TRAPs处理人中性粒细胞后，CCL3、CCL4、CXCL1和CXCL16在 mRNA水平上调，其中CCL3上调幅度最大，但是CCL2的mRNA表达变化没有统计学意义；在mRNA和蛋白水平上，人中性粒细胞表达CCL3随TRAPs浓度的增加而逐渐增加，并且随孵育时间的延长而逐渐增加。
3. TRAPs 诱导人中性粒细胞 NF-κB 信号通路发生明显磷酸化；TRAPs 诱导的NF-κB抑制剂预处理的人中性粒细胞CCL3 mRNA表达及蛋白含量都显著减少，而p38和Stat3抑制剂预处理的人中性粒细胞CCL3表达无明显变化。
4. TRAPs 诱导的人中性粒细胞能够促进 THP-1 细胞的趋化；而用 CCL3 封闭抗体进行封闭后，趋化的THP-1细胞数量显著减少。另外，TRAPs诱导的人中性粒细胞能够促进人中性粒细胞、PBMC的趋化。
结论：
1. TRAPs通过NF-κB信号通路上调人中性粒细胞CCL3的表达；
2. TRAPs促进人中性粒细胞对THP-1细胞、中性粒细胞和PBMC的趋化作用。