鞘磷脂和硫苷脂的鸟枪法脂质组学分析及其应用

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本文主要分为四个部分。第一部分以小鼠大脑为分析样本,建立直接进样电喷雾串联质谱测定鞘磷脂和硫苷脂的分析方法。第二部分以小鼠大脑为分析样本,建立流动注射电喷雾串联质谱测定鞘磷脂和硫苷脂的分析方法。第三部分对直接进样电喷雾串联质谱和流动注射电喷雾串联质谱测定鞘磷脂和硫苷脂的两种分析方法进行比较。第四部分利用直接进样电喷雾串联质谱法测定了三种动物脑组织(鸡脑、鸭脑、猪脑)中鞘磷脂和硫苷脂含量,研究了不同储藏温度下猪脑组织中鞘磷脂和硫苷脂的变化;利用流动注射电喷雾串联质谱法研究了硒对小鼠血浆中鞘磷脂的影响。首先,本文以小鼠大脑为分析样本对鞘磷脂和硫苷脂的提取方法、样品的进样速度、鞘磷脂和硫苷脂扫描模式的选择以及串联质谱参数等进行优化,建立直接进样电喷雾串联质谱测定鞘磷脂和硫苷脂的方法,并对该方法的线性关系、提取回收率、日内精密度及日间精密度进行了考察。最终选择改良的Bligh Dyer法结合氢氧化钠甲醇提取鞘脂,采用流动注射泵直接进样的方式以5μL/min的进样速度将样品导入电喷雾离子源,利用串联三重四级质谱的子找母扫描功能,扫描鞘磷脂和硫苷脂的特征性子离子,实现对鞘磷脂和硫苷脂的源内分离和鉴定。方法学评价显示:在5-2000ng/mL的线性范围内具有良好的线性关系(R2分别为0.9967和0.9913),其精密度(均小于8.72%)和回收率(88.7-107.8%)均符合分析要求,本方法具有前处理较简单,特异性强,灵敏度高,定性和定量快速准确,方法稳定等特点,可满足生物样品中鞘磷脂和硫苷脂检测的需要。其次,本文以小鼠大脑为分析样品,对样品的进样速度、进样量、流动相、串联质谱参数等相关参数进行了选择优化,建立了流动注射电喷雾串联质谱测定鞘磷脂和硫苷脂的方法,并对该方法的线性关系、提取回收率、日内精密度及日间精密度进行了考察。最终,脑组织样品经改良的Bligh Dyer法结合氢氧化钠甲醇处理后提取鞘脂,在直接进样电喷雾串联质谱定性的基础上,分别以含0.1%甲酸的甲醇溶液和纯甲醇溶液作为流动相将样品采用流动注射泵直接进样的方式以0.15mL/min的进样速度导入电喷雾离子源,利用串联三重四级质谱的多离子反应监测模式扫描,实现对鞘磷脂和硫苷脂源内分离和鉴定。方法学评价显示:在5-2000ng/mL的线性范围内具有良好的线性关系(R2分别为0.9954和0.9972),其精密度(均小于8.21%)和回收率(87.3~103.2%)均符合分析要求,本方法具有自动化程度高,定性定量准确且方法稳定,前处理较简单,特异性强,分析速度快等特点,可满足生物样品中鞘磷脂和硫苷脂分析的需要。再次,本文对前期建立的两种测定鞘磷脂和硫苷脂的电喷雾串联质谱方法进行比较,发现这两种方法在仪器配备和自动化程度上略有差别,但两者灵敏度和准确性都较高,操作简便,特异性强,因此两种方法都适合分析生物样本中鞘磷脂和硫苷脂的含量。最后,将两种方法分别应用于实际样品的检测。直接进样电喷雾串联质谱法测定三种动物脑组织(鸡脑、鸭脑、猪脑)中鞘磷脂和硫苷脂的含量中发现,三种动物脑组织鞘磷脂和硫苷脂分子种成分接近,但是相对含量有所差别,同属禽类脑的鸡脑和鸭脑鞘磷脂和硫苷脂分子种相对含量相近,而与属畜类脑的猪脑有所差别,这些差别有望用于不同动物脑组织来源的鉴定。直接进样电喷雾串联质谱法研究猪脑组织在不同储藏过程(+20℃,+4。C和-20℃温度下分别储藏36h,7d和60d)中,鞘磷脂和硫苷脂含量的变化过程中发现,鞘磷脂和硫苷脂含量基本上呈现逐渐上升,再缓慢减少,最后趋于稳定的趋势。+4。C储藏条件下,鞘磷脂和硫苷脂的氧化和水解速度明显慢于+20。C储藏条件。在-20。C储藏条件下在60d的储藏过程中,鞘磷脂和硫苷脂含量基本没有变化,表明鞘磷脂和硫苷脂在低温储藏过程中能够保持长时间的稳定。流动注射电喷雾串联质谱法测定硒对小鼠血浆中鞘磷脂的影响中发现,随着膳食中补充硒的浓度的增加,鞘磷脂的含量呈现递增趋势。
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