研究背景和目的经皮冠状动脉介入术（percutaneous coronary intervention, PCI）已成为目前国内外广泛应用的治疗冠心病的有效手段，但PCI术后半年内再狭窄（restenosis, RS ）率高达10%³0%，药物洗脱支架虽然可减少RS的发生，但术后RS率仍有10%左右，且费用昂贵，此外，药物洗脱支架植入后存在后期、远期支架内血栓形成而危及生命等问题，因而探索有效的RS防治措施一直是心血管病学领域的研究热点。大量研究表明，血管平滑肌细胞（ vascular smooth muscle cell, VSMCs）的增殖、迁移是新生内膜形成及RS发生的病理基础。近年来，肾素血管紧张素系统中越来越多新成员的发现使人们对肾素血管紧张素系统的认识更加全面和深刻。2002年，Nguyen等首次克隆发现肾素（原）受体[（pro）reninreceptor, （P）RR]。自从（P）RR被发现以来，关于（P）RR在肾脏和心脏中的生理及病理的作用受到越来越多的重视。Schefe等报道，肾素（renin）通过（P）RR促进大鼠H9c2心肌细胞的增殖并减少细胞的凋亡。Ichihara等报道，肾素原的柄区肽（handle region peptide, HRP），一种（P）RR的阻断剂，可抑制糖尿病肾病和心脏纤维化的发展。这些研究表明，（P）RR在各种生理及病理生理机制，特别是心血管疾病和糖尿病肾病的发病中发挥着十分重要的作用。一些肾素原在细胞内转化成肾素，另一些肾素原直接进入血液循环。血管组织对肾素原摄取较多，因此血管可能是肾素原转化为肾素的主要部位。而且血管平滑肌细胞已被证实存在肾素原受体，并且研究已证实，肾素和前肾素可通过（P）RR促进血管平滑肌细胞的增殖。因此，我们推断肾素原受体系统（The receptor-associated prorenin system, RAPS）将在RS的发生中起到十分重要的作用。故本研究将分别观察（P）RR在体外血管平滑肌细胞增殖中的作用及动脉损伤模型新生内膜中的作用。近年来的研究证实NADPH氧化酶是ROS生成的主要酶系。与吞噬细胞中NADPH氧化酶所生成的ROS不同，NADPH氧化酶所产生的ROS不主要起细胞防御功能，而是作为第二信使，参与细胞分化、增殖、凋亡的调节。在不同种类的细胞中发现了一系列NADPH氧化酶催化亚基即gp91phox的同源物，分别称其为NOX1，NOX2 （ gp91phox），NOX3，NOX4，NOX5，DUOX1，DUOX2，后来被命名为NOX蛋白家族。其中，在血管平滑肌细胞主要表达NOX1和NOX4。研究已证实，NOX1诱导的ROS可促进血管平滑肌细胞的增殖，而NOX4则与分化型的血管平滑肌细胞密切相关。因此，本研究将以NOX1为研究对象，进一步观察NOX1介导的ROS在PP（R）介导的血管平滑肌细胞增殖以及动脉损伤后内膜增生中的作用。研究方法本研究将分为以下四部分进行：实验一合成并鉴定有效RNA干扰质粒，本部分实验通过设计及构建4对（P）RR的pcDNATM6·2-GW/EmGFPmiR miRNA及1对阴性对照miRNA干扰质粒，通过DNA测序进行鉴定。将干扰质粒用LipofectamineTM 2000转染VSMCs，倒置荧光显微镜下观察绿色荧光及流式细胞术检测转染效率，real time-PCR及Western blot检测4对干扰质粒、阴性对照质粒对VSMCs （P）RR的mRNA及蛋白表达的影响。实验二观察肾素及其特异性受体对大鼠血管平滑肌细胞增殖、细胞周期素D1（Cyclin D1）及增殖细胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA）表达的影响，本部分实验将分为两部分：第一部分：探讨不同浓度肾素对VSMCs增殖、Cyclin D1及PCNA表达的影响，实验分为以下五组：①空白组（None）：未加任何处理；②对照组（Control）：给予Losartan （AT1受体阻断剂） 10^-6 mol/L和PD123319 （AT2受体阻断剂） 10 ^-5 mol/L；③Renin 10^-10组：给予10^-10 mol/L Renin处理；④Renin 10^-9组：给予10^-9mol/L Renin处理；⑤Renin 10^-8：给予10^-8 mol/L Renin处理。除空白组外，其余各组均给予Losartan 10^-6 mol/L和PD123319 10^-5 mol/L分别预处理30min，以阻断肾素的AngⅡ依赖性作用。第二部分：探讨（P）RR对VSMCs增殖、Cyclin D1及PCNA表达的影响，实验分为以下六组：①空质粒转染组（Negative）：转染空质粒；②对照组（Control）：转染空质粒后给予Losartan和PD123319处理；③Renin组：给予10^-9 mol/L Renin处理；④（P）RR干扰+Renin组：转染（P）RR干扰质粒后给予10^-9 mol/L Renin处理；⑤血小板源性生长因子-BB（Platelet-Derived Growth Factor BB，PDGF-BB）组：给予10nmol/L PDGF-BB处理；⑥（P）RR干扰+ PDGF-BB组：转染（P）RR干扰质粒后给予10nmol/L PDGF-BB处理。除空质粒转染组外，其余各组均给予Losartan 10^-6 mol/L和PD123319 10 ^-5 mol/L分别预处理30min，以阻断肾素的AngⅡ依赖性作用。所有实验步骤在同样的条件下至少重复三次。实验结束后，分别采用CCK-8法检测细胞增殖，流式细胞术检测各组细胞细胞周期，real-time PCR法检测各组CyclinD1、PCNA mRNA表达，western blot法检测CyclinD1、PCNA蛋白表达。实验三观察氧化应激在肾素及其特异性受体促大鼠血管平滑肌增殖中的作用及机制，本部分实验将以VSMCs为研究对象，分为以下两部分：第一部分：探讨DPI（NADPH氧化酶抑制剂）对肾素促VSMCs增殖、Cyclin D1及PCNA表达的影响，实验分为以下七组：①空白组：未加任何处理；②对照组（Control+Los+PD123319）：给予Losartan 10^-6 mol/L和PD123319 10 ^-5 mol/L；③Renin 10^-10组：给予10^-10 mol/L Renin处理；④Renin 10^-9组：给予10^-9mol/L Renin处理；⑤Renin 10^-8：给予10^-8 mol/L Renin处理。⑥Renin 10^-9+DPI组：给予10^-5 mol/L DPI处理30 min后给予10^-9mol/L Renin；⑦DPI组：给予10^-5 mol/L DPI处理；除空白组外，其余各组均给予Losartan 10^-6 mol/L和PD123319 10 ^-5mol/L分别预处理30min，以阻断肾素的AngⅡ依赖性作用。第二部分：探讨（P）RR在肾素诱导的氧化应激中的作用，将实验分为以下六组：①空质粒转染组（Negative）：转染空质粒；②对照组（Control）：转染空质粒后给予losartan和PD123319处理；③Renin组：给予10^-9 mol/L Renin处理；④（P）RR干扰+ Renin组：转染（P）RR干扰质粒后给予10^-9 mol/L Renin处理；⑤PDGF-BB组：给予10nmol/L PDGF-BB处理；⑥（P）RR干扰+ PDGF-BB组：转染（P）RR干扰质粒后给予10nmol/L PDGF-BB处理。除空质粒转染组外，其余各组均给予losartan 10 ^-6mol/L和PD123319 10 ^-5 mol/L分别预处理30min，以阻断肾素的AngⅡ依赖性作用。所有实验步骤在同样的条件下至少重复三次。实验结束后，分别采用流式细胞术检测各组细胞ROS含量及细胞周期，黄嘌呤氧化酶法测定各组细胞SOD活力；TBA法测定各组细胞MDA含量，real-time PCR法检测各组CyclinD1、PCNA和NOX1 mRNA表达，western blot法检测CyclinD1、PCNA和NOX1 mRNA表达。实验四进一步观察（P）RR在血管损伤后内膜增生中的作用，本部分实验通过建立大鼠颈动脉球囊损伤动物模型，将实验动物分为假手术组（PBS，n=10，灌胃）、损伤组（PBS，n=10，灌胃）、低剂量HRP组（10μg/kg/d，n=10，尾静脉注射）、高剂量HRP组（100μg/kg/d，n=10，尾静脉注射）和阳性对照losartan组（100 mg/kg/d，n=10，灌胃）。实验过程中每天尾静脉法监测鼠压，于14天取损伤动脉，采集血液，进行以下指标检测：HE法观察各组新生内膜增生情况；黄嘌呤氧化酶法测定血管SOD活力；TBA法测定血管MDA含量；realtimePCR法检测各组CyclinD1、PCNA和NOX1 mRNA表达；western blot法检测CyclinD1、PCNA和NOX1 mRNA表达。结果1实验一（P）RR miRNA干扰质粒的构建、筛选及转染条件的优化（1）成功构建了（P）RR miRNA的有效干扰质粒。（2）通过脂质体法瞬时转染大鼠血管平滑肌细胞，当质粒:Lipofectamine 2000为3:7.5时转染效率最高。（3）质粒:Lipofectamine 2000为3:7.5时转染质粒，其中重组质粒X2-2-3对（P）RR抑制率最高，故进一步的实验将选择重组质粒X2-2-3。2实验二肾素及其特异性受体对大鼠血管平滑肌细胞增殖、Cyclin D1及PCNA表达的影响第一部分：不同浓度肾素对VSMCs增殖、Cyclin D1及PCNA表达的影响（1） CCK-8法检测不同浓度Renin对VSMCs增殖的影响结果显示，与空白组比较，对照组OD值无显著差异（P>0.05）；与对照组比较，10^-10 mol/L Renin组、10^-9 mol/LRenin组、10^-8 mol/L Renin组OD值显著升高（均P<0.05），提示肾素可呈浓度依赖性促进VSMCs增殖，这种作用与AngⅡ生成无关。（2）流式细胞术检测不同浓度Renin对VSMCs细胞周期的影响结果显示，与空白组比较，对照组G1期构成比，S期、G2期构成比、增殖指数均无显著差异（均P>0.05）；与对照组比较，10^-10 mol/L Renin组、10^-9 mol/L Renin组、10^-8 mol/L Renin组G1期构成比显著降低，差异有统计学意义（均P<0.05），S期构成比及增殖指数显著升高，差异有统计学意义（均P<0.05），而G2期构成比无显著差异（均P>0.05），提示肾素可呈浓度依赖性促进VSMCs增殖，这种作用与AngⅡ生成无关。（3） real-time PCR、Western blot法检测不同浓度Renin对VSMCs Cyclin D1、PCNAmRNA和蛋白的影响结果显示，与空白组比较，对照组PCNA、Cyclin D1 mRNA和蛋白无显著差异（均P>0.05）；与对照组比较，10^-10 mol/L Renin组、10^-9 mol/L Renin组、10^-8 mol/L Renin组PCNA、Cyclin D1 mRNA和蛋白显著升高（均P<0.05），且呈浓度依赖性，提示肾素可呈浓度依赖性促进VSMCs Cyclin D1、PCNA mRNA和蛋白，这种作用与AngⅡ生成无关。第二部分探讨（P）RR对VSMCs增殖、Cyclin D1及PCNA表达的影响（1） CCK-8法检测（P）RR干扰对VSMCs增殖的影响结果显示，与Negtive组比较，对照组OD值无显著差异（P>0.05）；与对照组比较，给予PDGF-BB 10nmol/L处理后，细胞OD值显著升高（P<0.05），给予Renin 10^-9 mol/L处理后，细胞OD值显著升高（P<0.05）。与PDGF-BB处理组比较，RNAi+PDGF-BB处理组，细胞OD值显著降低（P<0.05）。与Renin处理组比较，RNAi+Renin处理组，细胞OD值亦显著降低（P<0.05）。提示（P）RR在VSMCs增殖中起重要作用。（2）流式细胞术检测（P）RR干扰对VSMCs的细胞周期的影响结果显示，与Negtive组比较，对照组G1期构成比，S期、G2期构成比、增殖指数均无显著差异（均P>0.05）；与对照组比较，给予PDGF-BB 10nmol/L和Renin 10^-9 mol/L处理后，G1期构成比显著降低，差异有统计学意义（均P<0.05），S期构成比及增殖指数显著升高，差异有统计学意义（均P<0.05），而G2期构成比无显著差异（均P>0.05）；与PDGF-BB处理组比较，RNAi+PDGF-BB处理组，G1期构成比显著升高，差异有统计学意义（P<0.05），S期构成比及增殖指数显著降低，差异有统计学意义（均P<0.05），而G2期构成比无显著差异（P>0.05）；与Renin处理组比较，RNAi+Renin处理组，G1期构成比显著升高，差异有统计学意义（P<0.05），S期构成比及增殖指数显著降低，差异有统计学意义（均P<0.05），而G2期构成比无显著差异（P>0.05）。进一步提示，（P）RR在VSMCs增殖中起重要作用。（3） real-time PCR和Western blot法检测（P）RR干扰对VSMCs cyclinD1、PCNA mRNA和蛋白的影响结果显示，与Negtive组比较，对照组PCNA、Cyclin D1 mRNA和蛋白无显著差异（均P>0.05）；与对照组比较，给予PDGF-BB 10nmol/L和Renin 10^-9mol/L处理后，PCNA、Cyclin D1 mRNA和蛋白显著升高（均P<0.05）；与PDGF-BB处理组比较，RNAi+PDGF-BB处理组，PCNA、Cyclin D1 mRNA和蛋白显著降低（P<0.05）；与Renin处理组比较，RNAi+Renin处理组，PCNA、Cyclin D1 mRNA和蛋白显著降低（P<0.05）。进一步提示，（P）RR在VSMCs增殖中起重要作用。3实验三氧化应激在肾素及其特异性受体促大鼠血管平滑肌增殖中的作用及机制第一部分探讨DPI（NADPH氧化酶抑制剂）对肾素促VSMCs增殖、Cyclin D1及PCNA表达的影响（1）不同浓度Renin对VSMCs细胞内ROS生成的影响，NADPH是其ROS的主要来源结果显示，与空白组比较，对照组平均荧光强度值无显著差异（P>0.05）；与对照组比较，10^-10 mol/L Renin组、10^-9 mol/L Renin组、10^-8 mol/L Renin组平均荧光强度值显著升高（均P<0.05），呈浓度依赖性，提示肾素可呈浓度依赖性促进VSMCs ROS生成，这种作用于AngⅡ生成无关。与对照组比较，DPI处理组平均荧光强度值无显著差异（P>0.05）；与10^-9 mol/L Renin组比较，Renin 10^-9+DPI组平均荧光强度值显著降低（P<0.05），提示，NADPH氧化酶在肾素通过（P）RR促进VSMCs产生ROS中起重要作用。（2） DPI对Renin处理后VSMCs细胞内SOD、MDA生成的影响结果显示，与空白组比较，对照组MDA、SOD水平无显著差异（均P>0.05）；与对照组比较，10^-10 mol/LRenin组、10^-9 mol/L Renin组、10^-8 mol/L Renin组MDA显著升高（P<0.05），呈浓度依赖性，而SOD水平显著降低（P<0.05），呈浓度依赖性，提示肾素可呈浓度依赖性促进VSMCs产生MDA，而抑制SOD生成，这种作用于AngⅡ生成无关。与对照组比较，DPI处理组MDA、SOD水平无显著差异（均P>0.05）；与10^-9 mol/L Renin组比较，Renin 10^-9+DPI组MDA水平显著降低（P<0.05），而SOD水平显著升高（P<0.05）。提示NADPH氧化酶在肾素通过（P）RR介导的作用中起重要作用。（3） DPI对Renin处理后VSMCs细胞周期的影响结果显示，与空白组比较，对照组G1期构成比，S期、G2期构成比、增殖指数均无显著差异（P>0.05）；与对照组比较，10^-9 mol/L Renin组G1期构成比显著降低（P<0.05），S期构成比及增殖指数显著升高（均P<0.05），而G2期构成比无显著差异（P>0.05）。提示肾素可呈浓度依赖性促进VSMCs增殖，这种作用于AngⅡ生成无关。与对照组比较，DPI处理组G1期构成比，S期、G2期构成比、增殖指数均无显著差异（均P>0.05）；与10^-9 mol/L Renin组比较，Renin 10^-9+DPI组G1期构成比显著升高（P<0.05），S期构成比及增殖指数显著降低（均P<0.05），而G2期构成比无显著差异（P>0.05）。提示NADPH氧化酶在肾素通过（P）RR介导的细胞增殖作用中起重要作用。（4） real-time PCR和Western blot法检测DPI对Renin处理后VSMCs cyclinD1、PCNAmRNA和蛋白的影响结果显示，与空白组比较，对照组PCNA、Cyclin D1 mRNA和蛋白无显著差异（均P>0.05）；与对照组比较，10^-9 mol/L Renin处理后，PCNA、Cyclin D1 mRNA和蛋白显著升高（均P<0.05），提示肾素可呈浓度依赖性促进VSMCs增殖，这种作用于AngⅡ生成无关。与对照组比较，DPI处理组PCNA、Cyclin D1mRNA和蛋白无显著差异（均P>0.05），与10^-9 mol/L Renin组比较，Renin 10^-9+DPI组PCNA、Cyclin D1 mRNA和蛋白显著降低（均P<0.05），提示NADPH氧化酶在肾素通过（P）RR介导的细胞增殖作用中起重要作用。第二部分探讨（P）RR在肾素诱导的氧化应激中的作用（1） （P）RR干扰对VSMCs细胞内SOD、MDA生成的影响结果显示，与Negtive组比较，对照组SOD、MDA水平无显著差异（均P>0.05）；与对照组比较，给予PDGF-BB10nmol/L和Renin 10^-9 mol/L处理后，MDA水平显著升高（均P<0.05），SOD水平显著下降（均P<0.05）。与PDGF-BB处理组比较，RNAi+PDGF-BB处理组，MDA水平显著降低（P<0.05），SOD水平显著升高（P<0.05）；与Renin处理组比较，RNAi+Renin处理组，MDA水平显著降低（P<0.05），SOD水平显著升高（P<0.05），提示NADPH氧化酶在肾素通过（P）RR介导的作用中起重要作用。（2） real-time PCR和Western blot法检测（P）RR干扰对VSMCs NOX1 mRNA和蛋白的影响结果显示，与Negtive组比较，对照组NOX1 mRNA和蛋白水平无显著差异（均P>0.05）；与对照组比较，给予PDGF-BB 10nmol/L和Renin 10^-9 mol/L处理后，NOX1mRNA和蛋白水平显著升高（均P<0.05）。与PDGF-BB处理组比较，RNAi+PDGF-BB处理组，NOX1 mRNA和蛋白水平显著降低（均P<0.05）；与Renin处理组比较，RNAi+Renin处理组，NOX1 mRNA和蛋白水平显著降低（均P<0.05），提示（P）RR在NADPH氧化酶的激活中起重要作用。4.实验四肾素（原）受体在血管损伤后内膜增生中的作用（1）颈总动脉损伤后各组对新生内膜影响的情况HE染色后用计算机图像分析系统检测各组动脉内膜和中层面积，结果显示，假手术组大鼠颈总动脉内腔面光滑，单层内皮细胞覆盖整个管腔，无新生内膜增生；与假手术组比较，损伤组在损伤后14d，新生内膜明显，造成明显的管腔狭窄，内膜/中膜面积比（I/M）显著增大（P<0.05）；氯沙坦组和高HRP组可见有新生内膜增生，但程度较损伤组明显减轻，内膜/中膜面积比（I/M）亦显著降低（均P<0.05）；而低HRP组新生内膜情况和I/M比值较损伤组无显著差异（P>0.05）。（2）颈总动脉损伤后HRP （肾素受体阻断剂）对血管壁细胞CyclinD1和PCNA mRNA和蛋白表达的影响结果显示，与假手术组比较，损伤组CyclinD1和PCNAmRNA和蛋白表达明显增高（均P<0.05）；与损伤组比较，losartan组、高HRP组CyclinD1和PCNA mRNA和蛋白表达明显降低（均P<0.05），而低HRP组则无明显变化（均P>0.05）；与losartan组比较，低HRP组CyclinD1和PCNA mRNA表达和蛋白无明显降低（均P>0.05）。（3）颈总动脉损伤后HRP对血管壁细胞SOD和MDA含量的影响结果显示，与假手术组比较，损伤组MDA水平明显增高（P<0.05），而SOD水平明显降低（P<0.05）；与损伤组比较，losartan组、高HRP组MDA水平明显降低（均P<0.05），SOD水平明显升高（均P<0.05），而低HRP组则无明显变化（均P>0.05）；与losartan组比较，高HRP组SOD和MDA水平无明显降低（均P>0.05）。（4）颈总动脉损伤后HRP对血管壁细胞NOX1 mRNA和蛋白表达的影响结果显示，与假手术组比较，损伤组NOX1 mRNA和蛋白表达明显增高（均P<0.05）；与损伤组比较，losartan组、高HRP组NOX1 mRNA和蛋白表达明显降低（均P<0.05），而低HRP组则无明显变化（均P>0.05）；与losartan组比较，高HRP组NOX1 mRNA和蛋白表达无明显降低（均P>0.05）。结论1.成功构建了（P）RR基因miRNA干扰质粒，并成功筛选出可有效干扰大鼠（P）RR基因的miRNA干扰质粒，为进一步实验奠定基础。2.肾素可通过（P）RR促进大鼠血管平滑肌细胞的增殖及CyclinD1和PCNA表达。3.肾素通过NADPH氧化酶-ROS通路促进大鼠血管平滑肌细胞的增殖及CyclinD1和PCNA表达。4. HRP（肾素受体阻断剂）可以抑制颈动脉损伤后新生内膜的增生、活性氧的生成及CyclinD1、PCNA和NOX1表达。