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目的：细胞周期检测点激酶1（Chkl）和细胞周期检测点激酶2（Chk2）是DNA损伤修复信号转导通路中非常重要的蛋白激酶。全新多肽P162对食管癌细胞株Eca109有明显的抗癌、放射增敏作用。它是否通过抑制细胞周期检测点信号转导通路增加食管癌细胞株的放射敏感性呢？本文拟检测它对Chk1和Chk2是否有抑制作用、对细胞周期的影响来进一步了解其放射增敏的机制。方法：1、诱导抗拒株Eca109R的形成：采用小剂量放射线反复照射Eca109细胞株，累计照射剂量达到60Gy，使其初步具有放射抗拒性；2、应用MTT法检测2、4、6、8Gy放射剂量对细胞的生长抑制率，确定最合适的放射剂量；3、CCK-8法检测5、10、20、40、60mg/L不同浓度的P162对Eca109R细胞株的生长抑制率，以明确P162最佳实验浓度；4、免疫荧光法检测Chk1与Chk2在细胞株中的阳性表达；5、将实验分为不加P162不照射组、加P162不照射组、不加P162照射组及加P162照射四大组，每组分别包含Eca109及Eca109R二种细胞株；6、Western blot检测四组细胞株中Chk1与Chk2蛋白表达的动态变化；7、流式细胞仪检测四组细胞株细胞周期的变化。结果：１、将细胞株未经照射组及照射2、4、6、8Gy组消化铺板，制成单细胞悬液，以未照射组为对照组，2、4、6、8Gy为实验组，分别在24h、48h、72h测OD值，计算细胞的生长抑制率，达到半数抑制率的剂量为后期实验的合适剂量。测得在6Gy的放射剂量时，细胞的生长抑制率在50%左右，故取6Gy为后续实验的放射剂量。２、CCK-8选取Eca109R的最适的药物浓度，以5、10、20、40、60mg/L为实验组，不加药组为对照组，在24h、48h、72h测OD值，计算细胞的生长抑制率，达到半数抑制率的浓度为后期试验的药物浓度。测得P162在20mg/L的浓度下，细胞生长抑制率在50%左右，故后续试验的浓度选取20mg/L.另外，在实验过程发现，随着P162剂量加大，细胞生长抑制率增加，说明P162对细胞抑制作用与剂量呈正相关。３、免疫荧光显示：食管癌Eca109及Eca109R细胞株中都存在少量的Chk1及Chk2表达，在细胞核与细胞质中均有表达，而且Eca109R细胞株中Chk1、Chk2的平均荧光强度高于Eca109细胞株，提示Eca109R中Chk1、Chk2的表达高于Eca109。４、western blot结果显示：①食管癌细胞株Eca109、Eca109R中存在一定量的Chk1与Chk2表达，经过6Gy照射后，随着时间变化发生变化，先逐渐增加后逐渐下降；②食管癌细胞株Eca109加用P162培养48h再经过6Gy照射后，Chk1与Chk2表达随时间变化呈逐渐下降的趋势；③食管癌细胞株Eca109加用P162培养48h与不加P162相比，Chk1与Chk2蛋白表达下降，加P162培养48h再照射后24h、48h，Chk1与Chk2蛋白表达下降更加明显；④食管癌细胞株Eca109R加用20mg/L的P162培养48h再照射后24h，Chk1及Chk2均明显下降，加用40mg/L P162培养48h再照射后24h，Chk1与Chk2表达下降更加明显，且低于加用20mg/L的P162组；⑤Eca109R细胞株中Chk1与Chk2的表达高于Eca109细胞株；Eca109及Eca109R加药组与未加药组比较，Chk1与Chk2的表达降低，在经过6Gy的射线照射后24h，二者下降更为明显；Eca109R加用40mg/L的P162培养48h时Chk1与Chk2的表达明显低于加用20mg/L的P162。Eca109及Eca109R两组细胞株中Chk1的表达高于Chk2，提示Chk1在食管癌Eca109的放射抗拒形成中可能起主要作用；两组细胞株加药经过6Gy照射后，Chk1与Chk2表达均发生变化，但Chk1蛋白的变化更明显，提示P162可能主要是通过抑制Chk1蛋白的表达来增加细胞株的放射敏感性。５、细胞周期测定：①Eca109、Eca109R照射后24h与照射前相比较，G2期明显增加，提示照射后出现G2/M期阻滞；Eca109R中G2期比例高于Eca109，提示Eca109R细胞株放射抗拒性高于Eca109细胞株；②Eca109、Eca109R加用20mg/L的P162培养48h未照射与照射后24h的G2期比例均较未加药组下降；③Eca109R加用40mg/L与加用20mg/L的P162相比，照射前G2期比例下降，说明随着浓度的加大，细胞周期阻滞解除更明显；照射后24h再比较，G2期比例下降更加明显，提示P162的作用与其浓度大小呈正相关。结论：1、食管癌细胞株Eca109R的放射抗拒性高于Eca109细胞株；2、食管癌细胞株Eca109及Eca109R的放射抗拒与Chk1及Chk2变化有关；3、P162能增加食管癌细胞株Eca109及Eca109R的放射敏感性；4、P162通过抑制Chk1与Chk2，解除细胞周期阻滞，使细胞进入对放射线相对敏感的M期，进而增加放射敏感性。