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高强度聚焦超声(High Intensity Focused Ultrasound,HIFU)是将体外发射的低能量超声聚焦到体内靶组织,通过机械效应、热效应和空化效应使靶组织产生不可逆性的凝固性坏死,实现治疗的目的。在实际的应用中,HIFU固有的局限性逐渐显露出来,比如治疗大体积或深部肿瘤时,HIFU的消融效率低,治疗时间长,可能导致并发症的发生。为了改善这一情况,学者们将目光集中在研究协同HIFU治疗的增效剂上,如碘油、超声微泡、液态氟碳纳米颗粒、羟基磷灰石、介孔二氧化硅等。虽然这些增效剂能提高HIFU的治疗效率,但肿瘤的主动靶向性和治疗的安全性问题却一直没有得到很好的解决。在此,我们制备了一种新型的基于厌氧细菌双歧杆菌的肿瘤靶向载体,连接具有HIFU增效作用的载液态氟碳全氟己烷的高分子纳米颗粒,这种新型的HIFU增效剂具备肿瘤的特异靶向性和生物安全性,能长时间的滞留在肿瘤靶区,而不存在于周围正常组织,并能改变肿瘤组织的声环境和微环境,显著增强HIFU消融效果,为HIFU生物靶向增效剂的研究提供一种新思路。目的1.制备载液态氟碳(全氟己烷,PFH)的聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)纳米粒(PFH/PLGA),通过优化反应条件,采用碳二亚胺法将PFH/PLGA纳米粒缀合到长双歧杆菌(Bifidobacterium longum,B.longum)表面(PFH/PLGA-B.longum),制备一种新型的HIFU增效剂,并对其基本性质进行检测。2.观察PFH/PLGA-B.longum对肿瘤靶向性,检测其对肿瘤组织声环境的影响,探讨作为HIFU生物靶向增效剂的可行性。3.评价新型HIFU生物靶向增效剂PFH/PLGA-B.longum的HIFU消融裸鼠肿瘤的治疗效果。方法1.以PLGA为外膜材料,PFH为内核,采用超声双乳化法将PFH包裹在PLGA纳米粒中制备PFH/PLGA纳米粒作为HIFU增效剂,对其表面形态、粒径、电位等进行检测;采用碳二亚胺法活化PLGA纳米粒子表面的羧基,利用傅里叶红外光谱仪(FTIR)和核磁共振氢谱(~1H-NMR)对其表面化学基团的改变进行检测,再通过厌氧条件下的共孵育,将PFH/PLGA纳米粒子与厌氧益生菌双歧杆菌进行连接;激光共聚焦显微镜(CLSM)、原子力显微镜(AFM)观察;流式细胞仪(FCM)分析连接效率;体外厌氧培养检测双歧杆菌的生物活性。2.15只荷瘤裸鼠随机分为3组,每组5只。设置PBS组、PFH/PLGA组与实验组PFH/PLGA-B.longum进行对照,通过小动物活体荧光成像仪对PFH/PLGA-B.longum的靶向能力和在肿瘤内的驻留时间进行观察;革兰染色、匀浆培养对双歧杆菌在肿瘤内的增殖能力进行检测;Masson染色和CD34染色分析了双歧杆菌增殖对肿瘤微环境的影响;60只荷瘤裸鼠随机分为6组,每组10只。非线性高能超声和生物力学压缩实验对肿瘤的声学特性及组织硬度定量分析。3.设置单纯HIFU治疗组、PBS+HIFU组、B.longum+HIFU组、PLGA+HIFU组、PFH/PLGA+HIFU组和PFH/PLGA-B.longum+HIFU组,通过90 W 3 s、120 W 3 s、150 W 3 s三组不同梯度HIFU治疗剂量,观察即刻各组HIFU消融后靶区灰度值变化,24 h后TTC染色观察凝固性坏死体积、计算各组能效因子以及免疫组织化学染色综合评价治疗效果。经尾静脉注射制备的新型HIFU生物靶向增效剂PFH/PLGA-B.longum后1 d、7 d、14 d收集血液样品送生化分析。结果1.激光共聚焦显微镜(CLSM)和扫描电镜(SEM)观察所制备的PLGA及PFH/PLGA纳米粒表面光滑、形态规整、粒径大小均匀,分散性佳。马尔文激光粒度仪测得PLGA与PFH/PLGA纳米粒粒径分别为160.7±5.4 nm、213.4±3.6 nm,表面电位分别为-9.55±3.82 mV、-16.3±5.46 mV,PFH包封率为44.45±1.27%。加入EDC/NHS活化纳米粒表面修饰的羧基后,FTIR与~1H-NMR检测结果表明NHS与PLGA成功合成。CLSM与AFM观察PFH/PLGA纳米粒子经碳二亚胺法缀合到双歧杆菌表面(PFH/PLGA-B.longum),且稳定性好。FCM检测PFH/PLGA纳米粒与双歧杆菌结合率84.34±4.35%,与对照组差异有统计学意义(P<0.05)。厌氧培养双歧杆菌得到与未特殊处理的双歧杆菌相似的生长特征曲线。2.PFH/PLGA-B.longum有较强的肿瘤特异靶向性,小动物活体荧光成像仪观察至168 h肿瘤内仍有较强的荧光信号显示,而在其他组织器官中没有荧光信号显示。革兰染色和匀浆培养结果表明双歧杆菌仅在肿瘤组织内定植和增殖,而不分布于其他器官。Masson染色和CD34染色显示PFH/PLGA-B.longum组胶原纤维和微血管密度为11.31±2.33%、7.38±2.26%,与未注射双歧杆菌的其余组别差异有统计学意义(P<0.05)。非线性高能超声系统及生物力学压缩实验测得PFH/PLGA-B.longum组平均声速、声衰减和弹性模量值分别为1788.14±72.92 m/s、2.86±0.59 dB/cm和14.89±3.54 KPa。3.HIFU消融实验研究结果表明,使用三组不同梯度的HIFU治疗剂量,PFH/PLGA-B.longum组的灰度值最高,与其余各HIFU治疗组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。TTC染色肿瘤凝固性坏死大体观察,PFH/PLGA-B.longum组凝固性坏死体积最大,与其余各HIFU治疗组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。HIFU治疗后能效因子方面,PFH/PLGA-B.longum组的能效因子最低,与其余各HIFU治疗组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。在三组不同梯度的治疗剂量中,90 W 3 s组的实验组能效因子最低,与120 W 3 s、150 W 3 s相比,差异有显著性(P<0.05)。H&E、PCNA、TUNEL病理组织切片和免疫组化观察,PFH/PLGA-B.longum组HIFU消融后细胞核碎裂溶解更明显,细胞增殖核抗原(PI)最低,细胞凋亡率(AI)最高,百分比分别为11.61±3.81%、77.50±5.74%,与其余各治疗相比差异有统计学意义(P<0.05)。生化指标检测肌酐(CREA)、血尿素氮(BUN)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)在注射前后无明显变化(P>0.05)。结论1.PFH/PLGA纳米粒通过共价偶联成功与双歧杆菌表面进行了高效稳定的连接,制备了PFH/PLGA-B.longum复合物,经体外厌氧培养,较未特殊处理的双歧杆菌保持了无明显差异的生物活性。2.PFH/PLGA-B.longum长时间富集在肿瘤部位,而不存在其他组织器官。组织病理切片显示胶原纤维的合成增加、新生血管的生成抑制。PFH/PLGA-B.longum组声速、声衰减、弹性模量值明显增加,改变了肿瘤组织声学环境和微环境。3.新型HIFU生物靶向增效剂PFH/PLGA-B.longum协同增强HIFU消融效果,体内生物相容性和安全性好,为HIFU生物靶向增效剂的进一步研究提供了一种新的思路和方法。