大豆疫霉(Phytophthora sojae)是植物病原卵菌的代表性物种之一,它引起的根腐病是大豆生产上的毁灭性病害之一,每年给全球大豆生产造成上几十亿美元的经济损失。大豆疫霉虽然在菌丝形状上与低等真菌相似,但在进化关系上却与真菌相差甚远,在致病机制上与真菌存在很大差异。因此,研究疫霉菌相对独特的致病分子机制,将有利于设计与开发特异的作物疫病防控药剂。由于疫霉菌的遗传操作较为困难,利用传统的功能基因的研究方法耗时耗力、成本高、效率低。因此我们借助高通量的蛋白组学与转录组学分析,来帮助我们提高鉴定重要基因的效率。本研究首先对大豆疫霉菌丝阶段、孢子囊阶段以及菌丝侵染大豆阶段进行了磷酸化蛋白组的测定,获得了许多在孢子囊阶段或侵染阶段被磷酸化的蛋白质。在此基础上,发现大豆疫霉中的一个在菌丝阶段、侵染阶段以及孢子囊阶段都能被磷酸化的MAPK蛋白,即PsMPK7。为了研究该基因的功能,首先对该基因的模型进行校正后,对PsMPK7进行基因沉默,发现了该基因不仅参与大豆疫霉的致病力、有性生殖以及对外界胁迫的应答之外,而且影响了胞外的漆酶活性。用酵母双杂交与亲和纯化的方法对其互作蛋白进行了筛选与验证。本文主要内容如下:大豆疫霉菌丝、孢子囊以及侵染大豆阶段的定量磷酸化组数据分析:对本次定量磷酸化蛋白组数据分析后发现,侵染阶段共鉴定到4577个磷酸化位点,孢子囊阶段共鉴定到3353个磷酸化位点。在菌丝阶段与侵染阶段的混合样品中共检测到42个效应分子(包括28个RxLR,5个NLP,7个CRN和2个elicitin类效应分子),同时鉴定到14个ABC转运蛋白、20个转录因子以及107个蛋白激酶等被磷酸化。在菌丝阶段和孢子囊阶段的混合样品中鉴定到16个效应分子(1个NLP和15个RxLR类效应分子)、9个ABC转运蛋白、15个转录因子以及47个蛋白激酶被磷酸化。对其磷酸化水平进行分析后发现,侵染阶段、孢子囊阶段的菌丝与菌丝阶段相比,有的蛋白磷酸化的水平发生了变化,有的并未变化,还有的蛋白只在混合样品中的一个阶段被磷酸化,而无法对其磷酸化水平进行定量。本研究率先对大豆疫霉被磷酸化的蛋白进行了定量磷酸化组鉴定,结果为研究植物病原卵菌与寄主的互作提供了基础数据。PsMPK7的功能分析及互作蛋白的筛选:在定量磷酸化蛋白质组中,检测到了PsMPK7在菌丝阶段、孢子囊阶段和侵染阶段都被磷酸化。PsMPK7在转录组中显示在游动孢子,休止胞以及休止胞萌发阶段均上调表达。将PsMPK7的基因模型校正清楚之后,利用基因沉默的方法对PsMPK7的功能进行了研究,结果发现PsMPSK7沉默后致病力减弱,卵孢子产量下降,而且突变体影响了菌株对外界胁迫的耐受性。本研究我们发现该基因的沉默也影响了漆酶的活性。我们用酵母双杂交的方法分别验证了4个MEK与PsMPK7激酶区域的互作,发现彼此都不互作。但这并不意味着它们真的就不互作,产生这种结果的原因可能有:1.大豆疫霉中MEK与MAPK的磷酸化互作只是瞬时的,用酵母双杂交这种体系不适合验证它们之间短暂瞬时的互作;2.大豆疫霉的MAPK和MEK之间不存在直接互作关系,在大豆疫霉MAPK信号通路中有可能存在某些中间蛋白参与到两者的互作中;3.不完整的蛋白也有可能是它们被验证不互作的原因。接下来将基因的全长连上3xFlag标签,通过亲和纯化的方法在大豆疫霉的体内筛选与之互作的蛋白。鉴定到的113个蛋白,包括:蛋白激酶、14-3-3类蛋白、actin蛋白等。由于时间有限,候选蛋白与PsMPK7的互作及其生物学意义还有待进一步验证和解析。