【摘 要】
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目的通过酵母双杂合体系研究乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)与细胞色素C氧化酶3(COXIII)相互作用的位点。方法用常规PCR和分子克隆技术构建HBV X变异体2种(X1编码HBV X蛋白1-72氨基
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目的通过酵母双杂合体系研究乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)与细胞色素C氧化酶3(COXIII)相互作用的位点。方法用常规PCR和分子克隆技术构建HBV X变异体2种(X1编码HBV X蛋白1-72氨基酸,X2编码HBV X蛋白1-117氨基酸)到穿梭质粒pAS2-(1含GAL4 -BD)上,通过醋酸锂方法转化入酵母AH109,以pAS2-1/X全长为对照;通过Western Blot的方法验证HBV X全长及变异体-BD融合蛋白在酵母细胞中的表达;经过滤膜转印法检测它们的自激活作用,将pAS2-1/X全长及变异体与pACT2/COXIII(pACT2含GAL4-AD)分别转化入酵母AH109及Y187中,进行酵母双杂交,在SC/-trp-leu检测转化效率,通过蓝白斑筛选检测β-半乳糖苷酶的活性从而得出HBx与COXIII的大致作用位点。结果pAS2-1/X变异体通过双酶切,PCR均检测出相应的片段,测序结果也符合预期。提取已转化入变异体的酵母AH109的DNA及蛋白,PCR和Western Blot验证pAS2-1/X全长及变异体-BD融合蛋白在酵母AH109中的成功表达。滤膜转印法排除了它们的自激活作用。经过与已转化有pACT2/COXIII的酵母Y187双杂交后,在SC/-trp-leu平板上有菌落生成,通过蓝白斑筛选,pAS2-1/ X1及pAS2-1/ X2均未使菌落变蓝。结论成功构建pAS2-1/ X变异体,并在酵母中成功表达。pAS2-1/ X变异体1和2均无自激活作用,并均不含与COXIII结合的位点,推测HBV X蛋白与COXIII的结合位点很可能位于HBx第118-154氨基酸。
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