蒸制人参茎叶提取物体外抗炎及体内保肝作用机制研究

来源 :北京林业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:hzduoying001
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人参(Panax ginseng C.A.Meyer)为五加科(Araliaceae)人参属多年生草本植物,含有多种生物学和药理学活性成分,是国内外广泛使用的药用植物,同时也是著名的功能性食品和膳食补充剂的明星原料植物。人参最主要的食用部位是根,致使迄今为止有关人参的研究也就主要集中于人参的根,其地上部分(如茎、叶、花、果实)备受忽视乃至惨遭丢弃。人参植株对生长环境要求苛刻,且生长缓慢,即便是人工集约栽培下的园参,人参根的获得通常也需要5-10年,加上其生长环境的独特性,产区范围狭窄,产量低,供不应求。人参皂苷为人参植株中公认的主要活性成分,但是从人参根中分离单一人参皂苷成本较高,并且产量有限,因此每年都可以收获的人参茎叶可成为获得人参皂苷的理想资源。在一定的蒸制条件下,原本存在于人参植株中的极性人参皂苷会转化成活性更高的低极性人参皂苷。由于Rg3,Rg5,Rk1和Rh2等低极性人参皂苷的产生,蒸制人参具有更强的抗癌活性;另外,新鲜人参在蒸制后变成的红参不仅对微生物感染有保护作用,而且对记忆有积极影响;蒸制人参还能够减轻与慢性疾病相关的氧化应激,改善外周循环障碍。然而,关于人参茎叶在蒸制过程中人参皂苷组成的变化、皂苷的转化机制和蒸制前后的人参茎叶提取物所具有的生物学和药理学活性仍不清楚。本研究以120℃下蒸制不同时长(0h、2h、4h、6h)所得人参茎叶提取物(GSE0、GSE2、GSE4、GSE6)为研究材料,比较和探究了这些提取物的人参皂苷、总酚、总黄酮和抗氧化能力的变化及机制,并通过脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞模型进一步比较了不同提取物的抗炎活性;筛选出了低极性皂苷和总酚、总黄酮含量最高,抗氧化、抗炎能力最强的提取物,并进一步用此提取物,通过小鼠急性肝损伤模型,进行了体内抗炎机制研究,进一步证实了其抗炎和保肝作用;最后,结合转录组和代谢组两类组学技术对其保肝作用的分子机制进行了深度研究。主要研究结果及结论如下:(1)利用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术共鉴定出35种人参皂苷,除了GSE0中存在的15种人参皂苷,其余的20种都是蒸制之后形成的。借助18个人参皂苷标准品,采用高效液相色谱(HPLC)法对GSE0、GSE2、GSE4、GSE6中的人参皂苷含量进行测定,发现人参茎叶经过120℃蒸制之后的皂苷HPLC图谱变化很大,出峰时间在25-90min的11个极性皂苷逐渐降低甚至消失,从1.338±0.083降低到0.290±0.013 mg/g;出峰时间在115-140min的7个低极性皂苷逐渐增加并达到最大值,从0.006±0.000上升到0.455±0.203 mg/g,从而确定了获得低极性人参皂苷的最佳条件。福林酚法测得的总酚含量从2666.01±38.92增加到4733.01±178.23 mg GA eq/100g d.w.;氯化铝比色法测得的总黄酮含量从7771.40±168.49增加到11610.52±260.46 mg RT eq/100g d.w.;DPPH和ABTS测得的抗氧化能力也随着蒸制的时间呈上升趋势,DPPH自由基清除能力从3174.06±121.69上升到7492.75±1276.25μmol Trolox eq/100g.d.w.;ABTS自由基清除能力从3607.81±563.76上升到6937.5±590.89μmol Trolox eq/100g.d.w.。(2)通过LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型比较了其抗炎活性。细胞活力MTT实验表明,选取的三个浓度(25,50,或100μg/m L)的GSEs对细胞均无毒性;GSEs对炎症介质NO和炎症因子IL-6和TNF-α的释放都显示出抑制效果,并且抑制程度随着蒸制时间和浓度的增加而增强;炎症基因i NOS、COX-2、IL-6和IL-1β的m RNA表达活性也印证了此发现,由此筛选出GSE6作为抗炎活性最强的人参茎叶提取物。相关性分析表明,正是更高的低极性人参皂苷、总酚、总黄酮含量赋予了GSE6更强的抗氧化和抗炎能力。(3)进一步对人参茎叶提取物的抗炎作用进行体内探究。用5种不同浓度(50、100、150、200、250 mg/kg)的120℃下蒸制6h的人参茎叶提取物(GSE)对小鼠进行灌胃预处理7天,之后注射对乙酰氨基酚(APAP)制造肝损伤模型,通过检测转氨酶(AST、ALT),抗氧化酶(GSH、SOD),脂质过氧化酶(MDA、4-HNE),炎症因子(TNF-α、IL-1β、COX-2、i NOS),以及凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax、Caspase3-8-9),发现蒸制人参茎叶预处理过的小鼠可以预防APAP引起的肝损伤,并确定了最佳剂量,探讨了保肝机制,确认蒸制人参茎叶提取物可通过抗氧化、抗炎和抗凋亡预防肝损伤。(4)上述结果表明,蒸制人参茎叶提取物具有很强的保肝作用,但潜在的分子和代谢调控还不清楚,通过代谢组学和转录组学联合分析,首次发现蒸制人参茎叶可以通过上调胆汁分泌、视黄醇代谢以及氨基酸代谢通路相关基因和代谢物实现保肝护肝;这些基因和代谢物与抗氧化、抗炎、抗凋亡以及肝保护作用相关,并确定了15种新的代谢标志物和25个新的基因标志物,为人参茎叶保健作用的深度应用、新的保肝药物的发现和治疗提供新的视角和思路。
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