目的:多梳家族蛋白(Polycomb group proteins,PcGs)是一类高度保守、普遍存在,对胚胎发育和维持成体干细胞状态有重要作用的蛋白。最近发现,在P19多能干细胞中多梳家族Nspc1对Oct4、Sox2和Nanog等干性维持基因起正性调控作用,在二甲基亚砜(DMSO)诱导P19细胞向心肌分化过程中Nspc1的表达先降低后升高,染色质免疫沉淀联合DNA芯片实验结果提示Nspc1在包括Nkx2.5、Mef2c、Hand2等心肌分化标志基因的启动子附近有结合位点。因此,研究Nspc1在多能干细胞向心肌细胞分化中的功能,有利于进一步揭示心肌分化调控的分子机制。方法:1、Nspc1与各组织和细胞系之间的关系①利用RT-PCR、实时荧光定量PCR和Western blot技术,对成年大鼠的各组织和不同细胞系中Nspc1的表达差异进行分析。②以P19细胞为例,人为改变Nspc1的表达,通过免疫荧光技术和流式细胞术,对Nspc1蛋白的亚细胞定位及其对细胞周期的影响进行明确。2、P19细胞DMSO分化模型中Nspc1调控靶基因的作用分析①检测心肌分化模型中相关标志基因的RNA及蛋白水平变化:利用RT-PCR/实时荧光定量PCR和Western blot分析P19细胞在二甲基亚砜(DMSO)诱导下干细胞全能基因和Nspc1以及心肌marker基因的RNA及蛋白表达水平变化(0-16d)。②分析Nspc1基因改变对心肌分化模型中主控基因及心肌Marker基因表达的影响:在P19细胞DMSO诱导不同时间点(0h,6h,12h,24h,48h,72h)强制过表达或敲低Nspc1基因,监测心肌分化Marker基因(Nkx2.5、Gata4/6和Mef2c)表达的情况,推测Nspc1的下游靶基因。3、Nspc1对P19心肌分化模型中主要靶基因的调控机制①Nspc1结合靶基因启动子序列预测及ChIP实验分析:使用生物信息学软件分析靶基因的启动子结构,选用未诱导分化P19细胞群,利用抗nspc1抗体和抗组蛋白h2a泛素化抗体,进行染色质免疫共沉淀(chip)联合pcr技术探寻目的蛋白结合的序列,获得靶基因启动子区结合信息并进行表观遗传修饰状态分析。②靶基因启动子报告基因载体构建及其转录活性分析:用分子克隆技术从小鼠基因组中克隆靶基因启动区序列,连入pgl3-basic双荧光报告基因载体,构建相应的报告基因质粒;在p19细胞中过表达nspc1基因,采用哺乳动物细胞双荧光报告基因检测技术,检测受nspc1调控的靶基因相关启动子的转录活性差异,进行各启动子区段的活性差异检测,分析确认nspc1主要的效应靶基因及其启动子区精确调控位点。结果:1、nspc1在成年大鼠组织中表达,脑组织和心肌组织分别表达第一和第二位。在不同细胞系中,p19细胞中表达最高(p<0.05)。另外通过免疫荧光技术,显示nspc1表达以细胞核内为主;流式细胞技术结果提示当nspc1表达增加时,细胞周期s期增加,g2期减少(p<0.01)。2、在p19细胞向心肌分化过程中,心肌marker基因随着时间推移逐渐表达增加,干细胞全能因子的表达呈下降趋势,nspc1表达则呈先降后升的变化。差异有统计学意义。通过脂质体转染/sirna敲低技术,p19细胞培养0-72h,对此过程中干细胞全能因子、心肌marker基因和nspc1表达变化进行分析,结果显示,随着nspc1表达增加,mef2c和gata4的抑制越显著。差异有统计学意义。3、利用染色质免疫共沉淀(chip)联合pcr技术,发现正常p19细胞中,mef2c启动子区(-601bp~-180bp)组蛋白h2a泛素化水平较对照组高,当nspc1mab结合程度升高时,相应的组蛋白h2a泛素化水平也有所提高,而gata4启动子区组蛋白h2a泛素化水平较对照组低。不同细胞系空间角度(h9c2细胞,正常表达mef2c基因):在chip5区域(-601/-180)uh2a水平较高,同时也存在nspc1结合。差异有统计学意义。4、利用分子克隆和双荧光报告基因检测技术,结果显示重组报告基因质粒在p19细胞中的荧光素酶活性均明显增强。同时,mef2c-0.8kb具有更高的转录活性(p<0.001)。此外,三个报告基因质粒的荧光素酶活性均随Nspc1基因表达的增加而增加。差异有统计学意义。结论:本论文揭示了PcG家族蛋白Nspc1的一组新的靶基因转录调控模式,为我们深入研究DMSO诱导P19细胞向心肌细胞定向分化的调控机制提供线索。