蚊传播脑炎病毒是一类感染对象广泛危害严重的虫媒病毒,其易感动物包括鸟、猪、马,啮齿动物和人类。东部型马脑脊髓炎病毒、西部型马脑脊髓炎病毒、委内瑞拉型马脑脊髓炎病毒、西尼罗河病毒、高地J病毒、拉科鲁尼亚病毒、辛德毕斯病毒、日本脑炎病毒、圣刘易斯脑炎病毒、Ockelbo病毒、基孔肯尼亚热、登革热病毒等均在特定的地理区域危害公共卫生安全。该类病原的相同特征均是通过吸血蚊类介导,引起特定的人畜群体的季节性、地方流行性中枢神经系统感染和病毒血症。除日本脑炎、登革热和基孔肯尼亚热主要流行于东亚和非洲外,美洲大陆是上述大部分病原的疫源地和流行区域。但近年来,随着国际贸易的发展,各个大陆间的人流物流的迅猛发展,蚊传播脑炎病毒有从其疫源地向其它地理区域传播扩散的趋势。目前,除日本脑炎外尽管我国尚未出现大面积流行,但我国却广泛存在上述病原的易感动物和传播媒介。如果缺乏相应的检测防控技术,特别是高通量检测方法,让此类病原体自由通过人流/物流经国境关口传入,将会引起严重的公共卫生安全问题。为此,本论文旨在建立一种新型的检测方法,对此类病原进行高通量的检测,为保障国境口岸及国内公共卫生安全提供技术支撑。本论文获得的主要研究成果如下:(1)以水泡性口炎病毒为载体,构建了三株表达马脑脊髓炎病毒E2蛋白的重组病毒:rVSV-EEEV-E2、r VSV-WEEV-E2、rVSV-VEEV-E2。重组病毒在BHK细胞上增殖良好,并通过电子显微镜、RT-PCR以及免疫荧光染色鉴定构建正确。该重组病毒可以用作马脑脊髓炎病毒的替代物,用做检测方法标准物质。(2)通过加尾PCR法和体外转录的方法合成一系列新型的合成病毒RNA(svRNA),并通过测序和RT-PCR验证。由于svRNA的两侧带有病毒特异性引物的结合区,内部嵌入了来自于外源质粒的基因片段,由此可以被用作后续检测的病毒替代物,并具备验证假阳性扩增的能力。结果表明,svRNA可以作为基因检测试剂盒阳性质控样本。(3)应用独特的加尾法PCR和联用微流控电泳芯片,开发了一种适用于基因检测的WideSpace高通量扩增方法。据此开发了WsP-mRT-PCR联用Lab-on-Chip(芯片实验室)检测12种蚊传播脑炎病毒的检测方法包括:东部型马脑脊髓炎病毒、西部型马脑脊髓炎病毒、委内瑞拉型马脑脊髓炎病毒、西尼罗河病毒、高地J病毒、拉科鲁尼亚病毒、辛德毕斯病毒、日本脑炎病毒、圣刘易斯脑炎病毒、Ockelbo病毒、基孔肯尼亚热、Ⅲ型登革热病毒。其中,东部型马脑脊髓炎病毒、西部型马脑脊髓炎病毒、委内瑞拉型马脑脊髓炎病毒、西尼罗河病毒、高地J病毒和圣刘易斯脑炎病毒通过OIE马脑炎参考实验室提供的标准病毒的测试和验证。该方法的灵敏度为102拷贝/μL;方法的特异性和再现性均达到同类检测方法的水平;方法的可靠性和荧光RT-PCR相当;其优势在于可以同时高通量的检测多个病原。(4)开发了适用于病毒WsP-mRT-PCR检测方法的分析软件:《病毒特征判读软件V1.0》。该软件基于基因扩增产物的浓度和长度可以对检测数据进行自动的分析和结果报告。(5)应用本研究建立的检测方法,对来自于重庆市三峡库区五个县镇的2000余只蚊子进行了本类病原的监测。结果表明,有2/115(1.7%)的蚊子检出乙型脑炎病毒,没有发现东部型马脑脊髓炎病毒、西部型马脑脊髓炎病毒、委内瑞拉型马脑脊髓炎病毒、西尼罗河病毒、高地J病毒、拉科鲁尼亚病毒、辛德毕斯病毒、日本脑炎病毒、圣刘易斯脑炎病毒、Ockelbo病毒、基孔肯尼亚热、Ⅲ型登革热病毒中的任何一种。(6)通过项目研究,制订了SN行业标准两项:SN/T 2863-2011马脑脊髓炎(东部型和西部型)检疫技术规范和SN/T 2833-2011委内瑞拉马脑脊髓炎检疫技术规范。