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植物络合素(Phytochelatins,PCs)是在植物细胞内广泛存在的一种可以有效螯合Cd2+、Pb2+、Cu2+等重金属离子的多肽类化合物,其具有高度保守的一级结构:(γ-Glu-Cys)n-Gly(n=2~11)。在植物和酵母细胞内,PCs对游离重金属离子的富集和解毒过程具有重要作用,而植物络合素合酶(Phytochelatin synthase,PCS)是催化其合成的关键酶。本实验研究以Pb2+胁迫条件下的苦荞叶片转录组数据为基础,通过RT-PCR克隆了苦荞植物络合素合酶(FtPCS)基因CDs序列和DNA序列,并对其进行了一系列的生物信息学分析。随后,将获得的苦荞FtPCS基因CDs序列分别转化E.coli BL21 Star(DE3)、酿酒酵母YK44突变体菌株、以及拟南芥植株进行异源表达,并对其在重金属Cd2+胁迫条件下的功能和表达特点进行分析,以期为进一步揭示FtPCS在苦荞植物重金属富集和解毒过程中的机制奠定基础。本研究得到的主要结论有:(1)苦荞植物络合素合酶(FtPCS)基因的CDs序列长1 485 bp,编码494个氨基酸,预测分子量为55.10 kDa;FtPCS基因的DNA序列长5 456 bp,由8个外显子和7个内含子组成,且内含子两侧的剪接位点均满足GT-AG规则。生物信息学分析表明,FtPCS基因氨基酸序列N-端序列高度保守,包括5个保守的Cys-残基特征位点,是FtPCS蛋白活性中心;C-端序列包含12个可变的Cys-残基位点,是主要的重金属离子结合位点。(2)通过NEBuilder HiFi DNAAssembly技术,构建pET28a-PCS重组表达载体,转化E.coli BL21 Star(DE3)并通过IPTG诱导表达。可溶性分析结果表明,FtPCS在E.coli内以包涵体的形式大量表达。通过Co2+螯合层析结合梯度透析复性,获得了纯化的FtPCS蛋白;通过反向-HPLC结合DTNB[5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)]柱后衍生的方法,对FtPCS重组蛋白在Pb2+存在条件下的催化活性进行分析。结果表明,纯化的FtPCS蛋白具有催化活性,能将还原型谷胱甘肽(GSH)络合生成PC化合物,而低浓度的Pb2+对其活性具有激活作用。(3)通过NEBuilder HiFi DNAAssembly技术,构建pYES2-PCS酵母表达载体,转化对重金属离子Zn2+/Cd2+/Ni2+/Co2+敏感的酿酒酵母YK44突变体菌株,并通过半乳糖诱导表达。酵母功能互补实验结果表明,在不同浓度Cd2+胁迫条件下,转化pYES2-PCS重组质粒的酵母菌株比转化空载的酵母菌株对重金属Cd2+的耐受性明显提高。在Cd2+胁迫条件下的酵母生长曲线同样表明,FtPCS基因在酵母细胞中的表达,能够弥补其重金属抗性基因的缺陷,从而提高其对Cd2+的抗性。(4)构建pCAMBIA3301-PCS植物表达载体,转化农杆菌GV3101,并通过花序浸染法转化拟南芥植株。通过Basta筛选和PCR扩增鉴定,目前已获得部分T2代阳性转基因株系。该研究结果为进一步筛选T3代纯合转基因株系奠定基础,为进一步研究植物在重金属富集和解毒方面的机制奠定基础。