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目的:动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)导致的冠心病严重威胁人类健康。大量研究表明:AS是一个血管内壁受损之后发生的一系列慢性炎性反应的过程,同其他炎症性疾病一样,炎性反应在AS发生、发展过程中发挥着重要作用,贯穿于AS的各个病变过程。在AS炎症中发挥重要作用的炎性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)中的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1是细胞焦亡(一种新发现的程序性死亡方式)的关键分子,我们推测AS病变过程与细胞焦亡有关。研究发现AS发生发展的重要诱因氧化低密度脂蛋白(OX-LDL)会造成细胞骨架F-actin的微丝断裂、排列紊乱,甚至缺失。F-actin的结合蛋白NEXN在AS斑块中表达增高,但机制不明。本研究拟从细胞焦亡角度,用OX-LDL刺激细胞建立的细胞模型探讨NEXN在AS病理过程中发挥的作用及机制,为阐明AS病理机制提供实验依据。方法:在动脉粥样硬化形成过程中,沉积在动脉粥样硬化斑块里的细胞主要为:内皮细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞。因此课题选用人急性单核巨噬细胞白血病细胞(THP-1)进行研究。1.OX-LDL诱导THP-1细胞发生细胞焦亡1.1 OX-LDL诱导的THP-1细胞焦亡检测用脂多糖(LPS)以及氧化低密度脂蛋白(OX-LDL)分别先后诱导THP-1细胞之后,通过EB(Ethidium bromide,溴化乙锭)、EthD-2染色检测细胞pyroptosis发生率、通过乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测细胞毒性以及通过聚合酶链反应(PCR)检测焦亡相关分子Caspase-1、IL-1β表达情况。蛋白免疫印迹(western blot,WB)检测活性caspase-1:Caspase-1 P10表达情况。1.2细胞焦亡抑制实验用Caspase-1抑制剂Z-YVAD-FMK处理THP-1细胞之后通过EB、EthD-2染色检测细胞pyroptosis发生率。2.在OX-LDL诱导THP-1细胞中NEXN对细胞焦亡的作用2.1 NEXN在OX-LDL诱导THP-1细胞中细胞焦亡时的表达情况用脂多糖(LPS)以及氧化低密度脂蛋白(OX-LDL)分别处理THP-1之后,检测细胞pyroptosis发生率、乳酸脱氢酶释放(LDH)、NEXN、焦亡相关分子:Caspase-1、IL-1β表达情况。2.2在OX-LDL诱导THP-1细胞中siRNA干扰NEXN后检测细胞焦亡情况为了进一步探讨在OX-LDL诱导THP-1细胞焦亡时表达增高的NEXN对细胞焦亡的作用,我们在THP-1建立的OX-LDL诱导THP-1细胞中干扰NEXN,检测细胞pyroptosis发生率、乳酸脱氢酶释放(LDH)、NEXN、焦亡相关分子:Caspase-1、IL-1β表达情况。2.3在OX-LDL诱导THP-1细胞中过表达NEXN后检测细胞焦亡情况为了进一步明确NEXN在AS中对细胞焦亡的作用,我们在OX-LDL诱导的THP-1细胞中过表达NEXN,检测细胞pyroptosis发生率、乳酸脱氢酶释放(LDH)、NEXN、焦亡相关分子:Caspase-1、IL-1β表达情况。结果:1.用40mg/ml浓度的OX-LDL诱导THP-1细胞后,OX-LDL的细胞焦亡发生率比control组高15%。2.OX-LDL诱导THP-1细胞细胞焦亡相关分子Caspase-1 mRNA转录水平是control组的2.74±0.32倍、IL-1βmRNA转录水平是control组的2.71±0.46倍,其蛋白表达水平也出现均不同程度的增高。3.OX-LDL诱导THP-1细胞中用Caspase-1抑制剂抑制细胞焦亡后,细胞焦亡发生率降低22%。4.在OX-LDL诱导THP-1细胞中细胞焦亡时,NEXN mRNA转录水平是control组的8.31±1.46倍,其蛋白表达水平也增高。5.在OX-LDL诱导THP-1细胞中siRNA干扰NEXN后,细胞焦亡发生率比siNC组升高35%,LDH比siNC组升高12.6%,IL-1β比siNC组升高28.6ng/ml,cleaved caspase-1蛋白表达量也增高。6.在OX-LDL诱导THP-1细胞中过表达NEXN后,细胞焦亡发生率比空载体组降低14%,LDH比空载体组降低29.8%,IL-1β比空载体组降低20.2ng/ml,cleaved caspase-1蛋白表达量也降低。结论:1.在OX-LDL诱导THP-1细胞中,细胞焦亡存在并发挥重要作用。2.在OX-LDL诱导THP-1细胞中,过表达NEXN,细胞焦亡减少;干扰NEXN的转录,细胞焦亡增加;说明了NEXN可能通过Caspase-1参与细胞焦亡的过程,NEXN可能对TP细胞焦亡有抑制作用。