背景糖尿病(Diabetes mellitus,DM)可导致冠状动脉粥样硬化、心肌肥厚、心肌纤维化甚至心力衰竭等多种心血管并发症,而这些并发症是DM患者最主要的死亡原因。近年来越来越多的研究显示,与其他心肌病不同,糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)有其独特的心肌重构模式,包括左心室重构及心肌能量代谢异常改变。目前认为DCM发病机制可能包括氧化应激、心肌慢性炎症、线粒体功能障碍、心肌细胞凋亡、间质纤维化和左心室肥厚等。由于DCM的发生、发展是一个多因素参与的病理生理过程,虽有大量研究试图探索DCM潜在的发病机制,但其具体的病理生理机制目前尚未完全阐述清楚。心血管并发症是DM患者的主要致死因素,虽然多种混合因素如高血压、血脂异常在此慢性病程中是主要参与者,但DM本身可导致心脏广泛的分子改变亦得到公认。因此,进一步探索DCM的发病机制可能为其临床治疗找到潜在的靶点及提供新的策略。芹菜素是一种广泛存在于蔬菜、水果和中草药中的黄酮类化合物,已有研究证实芹菜素具有抑制肿瘤细胞增殖、解痉、抗炎、抗氧化、抗动脉粥样硬化、降脂、降糖等多种药理学作用。鉴于其心血管保护作用,芹菜素在心血管研究领域逐渐受到关注。目前已有研究显示,芹菜素能减轻链脲霉素(streptozotocin,STZ)诱导的胰岛β细胞损伤及高糖诱导的内皮细胞功能障碍,但芹菜素在DCM中的作用及其具体分子机制尚不明确。因此,本研究将从在体和离体两方面探索芹菜素对DCM的影响,并进一步将芹菜素与白藜芦醇对高糖诱导H9c2细胞损伤的保护作用进行比较,从而明确芹菜素对DCM的保护作用及可能机制,为临床治疗DCM提供理论依据。目的探讨芹菜素对高脂饮食联合STZ诱导的糖尿病心肌病的影响,并阐明其可能机制。方法第一部分:采用高脂饮食和小剂量STZ诱导DCM模型并给予芹菜素进行干预,通过测量各组小鼠心脏重量(heart weight,HW)、体重(body weight,BW)、肺脏重量(lung weight,LW)和胫骨长度(tibial length,TL),并计算其比值评估小鼠营养及发育情况;通过HE染色比较小鼠心肌细胞横截面积的变化;运用超声心动图测定 HR、IVSd、IVSs、LVPWd、LVPWs、LVDd、LVDs、FS、EF等指标评估DCM小鼠心功能的变化;采用血流动力学检测小鼠LVESP、LVEDP、dp/dt max、-dp/dt min等指标评估小鼠左心室压力一容积参数;通过心脏组织切片的天狼星红(PSR)染色评估小鼠心肌间质及血管周围纤维化情况;运用Real time-PCR检测心肌肥厚标志物ANP、BNP和心肌纤维化标记物TGFβ、胶原蛋白Ⅰ(CollⅠ)、胶原蛋白Ⅲ(Coll Ⅲ)、纤维链接蛋白(Fn)、结缔组织生长因子(CTGF)及炎症因子TNfα、IL-1β、IL-6等mRNA表达量的改变;采用Western Blot测定心肌组织中IkBα、p-IkBα、TNFα等蛋白表达量评价心肌炎症反应及可能机制;免疫组组化学染色心肌组织4-羟基壬烯酸(4-HNE)及测定氧化应激相关指标丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)等表达水平和活性评估氧化应激情况;SDS-PAGE电泳测定细胞核及细胞质中NF-KB/p65蛋白表达量及免疫荧光染色组织切片评价心肌组织中NF-ΚB/p65核转位情况。TUNEL染色及Western Blot测定心肌组织中Bc12、Bax、c-caspase3等蛋白表达量评价心肌细胞凋亡情况。第二部分:采用高糖(HG)诱导H9c2心肌细胞损伤模型并予以芹菜素干预,通过Western Blot测定H9c2细胞中Bcl2、Bax、c-caspase3等蛋白表达量评价细胞凋亡情况;测定细胞中MDA、SOD、GPx等表达水平或活性评估氧化应激情况;RT-PCR检测炎症细胞因子IL-1β、IL-6和TNFαmRNA的表达;免疫荧光染色H9c2细胞核中NF-ΚB/p65评价其核转位情况。第三部分:采用HG诱导H9c2心肌细胞损伤模型并予以芹菜素或白藜芦醇干预,通过Western Blot测定H9c2细胞中Bcl2、Bax的蛋白表达量评价细胞凋亡情况;流式细胞术测定活性氧(ROS)水平比较氧化应激情况;通过采用Western Blot测定H9c2细胞核和胞质中NF-ΚB/p65的蛋白质表达量比较芹菜素和白藜芦醇对NF-ΚB/p65核转位的影响。结果第一部分:糖尿病组(DM)及糖尿病+芹菜素组(DM+A)血糖水平分别是对照组(CON)的5倍及4.6倍,而DM+A组血糖水平较DM降低;DM组BW及HW均较CON组降低,而DM+A组较DM则有所升高;STZ诱导的DM组小鼠心肌细胞体积和横截面积明显增大且心肌组织中的ANP和BNP表达量明显增加,给予芹菜素灌胃则可明显抑制心肌细胞肥大及下调ANP及BNP的表达;超声心动图提示DM小鼠心功能较CON组明显下降,芹菜素则明显抑制DCM相关的心肌重构及改善心功能。与此同时,血流动力学检测提示DM小鼠较CON组EF、FS、dp/dt和-dp/dt明显降低而IVSd、LVPWd和LVDd升高,芹菜素则可部分逆转这些参数变化。PSR染色显示DCM组小鼠纤维化程度较CON组明显增加,芹菜素干预则可以明显减轻心肌间质及血管周围纤维化程度;RT-PCR显示,DM小鼠心肌组织中的胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ、Fn、CTGF和TGFβmRNA的表达量明显升高,芹菜素则可逆转这些参数的变化。免疫组化染色显示,高糖和胰岛素抵抗可以明显促进心肌组织中4-HNE的聚集,而芹菜素可减少4-HNE的生成;与CON组相比,DM组小鼠心肌中MDA过表达,而抗氧化酶SOD和GPx活性则明显下调,芹菜素干预可抑制这些参数的改变。DM小鼠心肌组织中p-IkBα、TNFα蛋白表达量较CON组明显增加,DM+A组小鼠p-IkBα、TNFα蛋白表达量较DM组明显降低;与此同时,DM导致心肌细胞损伤的同时伴有明显的NF-ΚB/p65核转位,而芹菜素干预则明显抑制NF-ΚB/p65核转位;为进一步证实NF-ΚB/p65核转位情况,通过分别分离核蛋白和胞质蛋白进行电泳发现,DM+A组胞质中NF-KB/p65蛋白较DM组明显升高而细胞核中则较DM降低,此外,DM组IL-1β、IL-6和TNFα等炎症因子mRNA较CON组明显升高,芹菜素干预组小鼠心肌组织中相关炎症因子的mRNA表达量较DM明显降低。TUNEL染色显示DM促进心肌细胞凋亡,而芹菜素干预则明显抑制心肌细胞凋亡;此外,STZ诱导的DM小鼠心肌中c-caspase3及促凋亡蛋白Bax表达量较CON组明显上调,而抗凋亡蛋白Bcl2则较CON组下调,芹菜素则可明显逆转这些参数的变化。第二部分:高糖培养的H9c2细胞中c-caspase3、Bax蛋白表达较CON组明显上调而Bcl2表达下调,芹菜素则可明显抑制这一过程并下调Bax/Bcl2比率;氧化应激相关指标MDA、SOD、GPx的变化与在体实验结果相一致;此外,HG组IL-1β、IL-6和TNFα等炎症因子mRNA的表达较CON组明显升高,同时伴有明显的NF-ΚB/p65核转位,芹菜素则可明显抑制炎症细胞因子的表达及NF-ΚB/p65 核转位。第三部分:芹菜素和白藜芦醇均可提高Bc12蛋白的表达而抑制Bax表达,与此同时,高糖+芹菜素组(HG+A)和高糖+白藜芦醇组(HG+R)组H9c2细胞核中NF-ΚB/p65蛋白表达量较HG组明显降低,而胞质中NF-1ΚB/p65蛋白表达量较HG组明显升高,但此两组间的差异比较均无统计学意义。此外,流式细胞术显示高糖明显促进H9c2细胞中ROS的生成,芹菜素及白藜芦醇均可明显抑制H9c2细胞中ROS的生成。结论1.芹菜素可改善高脂饮食联合小剂量STZ诱导DCM模型心肌重构及心脏功能,并抑制心肌细胞凋亡,改善心肌氧化应激及炎症反应。2.芹菜素可明显抑制高糖培养的H9c2心肌细胞氧化应激及炎症反应,减少心肌细胞凋亡。3.芹菜素减轻高糖诱导的H9c2心肌细胞氧化应激、细胞凋亡及抑制NF-ΚB/p65核转位等心脏保护效应并不劣于白藜芦醇。4.芹菜素对DCM的心脏保护作用可能通过抑制NF-ΚB/p65相关信号通路激活实现的。