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【背景】由于地质污染、工矿业排污和废旧镍镉电池的处置不当,我国多数地区水体和土壤遭受镉污染,目前已经报道的有30余处,涉及全国16个省市自治区。这些镉污染区域的稻米、水产品和饮用水中镉的含量严重超标,导致镉污染的暴露人群数量巨大,镉暴露导致的骨代谢异常(痛痛病)、肾脏毒性和生殖毒性都严重威胁人类的健康,目前还没有治疗镉暴露导致疾病的有效手段,如何解决镉暴露对健康的危害已经成为刻不容缓的医学难题。目前已对镉毒性进行了广泛研究,其中较多研究集中在骨代谢异常,镉暴露引起的睾丸毒性、肝毒性也有不少报道。但是,镉致睾丸毒性以及肝毒性的确切机制,仍不清楚。有研究提示,镉致脏器毒性的机制可能与氧化应激损伤相关。硒是人体的必需微量元素,作为一种自由基清除剂,具有抗氧化和抗衰老功能。硒也是多种含硒蛋白的活性成分,在抗氧化中起着重要作用,除了可能抑制镉诱导的氧化损伤,硒还可能与镉直接进行化学性结合而降低镉的毒性。因此探讨硒拮抗镉诱导的抗氧化作用以及剂量效应关系,对于进一步采用人群适量补硒以发挥对镉的解毒作用,可能是一条比较理想和可行的途径。【目的】研究镉暴露大鼠肝脏、睾丸氧化损伤作用及硒干预的剂量效应关系,寻找有效的保护剂量,以初步阐明作用机制。【方法】以Brl-3A(大鼠肝细胞)、Sertoli(大鼠睾丸支持细胞)细胞和SD大鼠为研究对象,实验分为:阴性对照组、硒对照组、镉暴露组、硒干预组。研究镉造成的肝脏、睾丸氧化损伤,镉诱导细胞凋亡,硒对镉毒性的拮抗作用机制。1.动物水平实验:主要研究镉毒性及氧化损伤,硒对其拮抗作用的剂量效应关系。采用SD大鼠作为研究对象,通过灌胃氯化镉诱导大鼠肝脏、睾丸慢性氧化损伤,并同时在硒对照组和硒干预组灌胃给予亚硒酸钠处理,阴性对照组只给予生理盐水。采用免疫荧光研究硒对镉损伤的肝细胞、睾丸细胞中活性氧(ROS)水平的影响。蛋白免疫印迹法研究硒对镉诱导肝、睾丸细胞凋亡的保护作用。测定镉中毒大鼠肝脏、睾丸组织中硒对其氧化损伤的影响。主要的观察指标有大鼠睾丸和肝组织的病理变化,全血中氧化、抗氧化酶活力的变化,Nrf-2等抗氧化分子蛋白表达、细胞凋亡等指标的变化。2.细胞水平实验:主要研究镉致细胞氧化损伤、适当剂量硒对镉毒性的拮抗机制。在动物实验研究的基础上,采用Brl-3A细胞、Sertoli细胞作为研究对象,预先给细胞硒处理,再给予镉暴露,以进一步研究硒对镉损伤的保护作用机制。采用荧光标记法测定细胞中ROS的水平,Annexin V/PI法检测硒对镉暴露致细胞凋亡的保护作用。采用Mito-SOXTM荧光探针检测线粒体中ROS的水平以及线粒体膜电位的变化对线粒体的影响。蛋白免疫印迹法,分析细胞中凋亡、氧化还原相关蛋白,如Bcl-2、Bax、Nrf-2蛋白水平变化。进一步探讨硒拮抗镉毒性的相关机制。3.综合分析:将动物实验和细胞水平实验进行比对研究,寻找共同点与差异点,以提出初步硒对镉毒性拮抗的新思路。【结果】1.动物实验结果表明,镉暴露条件下,大鼠肝、睾丸细胞中ROS水平升高,丙二醛(MDA)水平升高,还原性谷胱甘肽(GSH)水平降低,细胞氧化水平升高。同时,镉暴露后,大鼠肝、睾丸细胞中Nrf-2及其调控的抗氧化酶GPx-1、SOD-2和CAT活力及蛋白水平表达降低,表明肝、睾丸细胞抗氧化能力下降,这些结果说明镉暴露条件下大鼠的肝脏、睾丸处于明显的氧化应激状态。2.在ROS作用下,镉可以使肝、睾丸组织中促凋亡蛋白Bax水平上调,而抗凋亡蛋白Bcl-2水平下调,导致细胞发生凋亡。细胞的氧化应激与凋亡导致血清中ALT、AST的水平升高,睾酮水平降低,肝功能、睾丸功能严重受损。3.细胞实验结果表明,镉暴露诱导ROS水平升高,可以使Brl-3A和Sertoli细胞活力降低,总的凋亡率升高说明镉暴露诱导细胞凋亡,线粒体膜电位降低表明细胞内外的质子浓度梯度发生改变,提示线粒体的氧化损伤可能与镉诱导细胞凋亡相关。4.给予硒干预后,大鼠肝、睾丸细胞中ROS水平降低,MDA水平显著降低,GSH水平升高;Nrf-2及其调控的抗氧化酶活力升高,蛋白表达水平升高;Bax水平下调,Bcl-2水平上调;表明硒可有效拮抗镉诱导的大鼠肝脏、睾丸的氧化损伤,且具有一定的剂量选择性。5.在Brl-3A、Sertolie细胞中,给予硒预处理,Brl-3A和Sertoli细胞ROS水平均降低,细胞凋亡率也降低,线粒体膜电位升高,Nrf-2等抗氧化分子蛋白水平升高,表明给予硒预处理能够有效抑制细胞中镉损伤。【结论】1.镉暴露可导致大鼠肝脏、睾丸细胞凋亡、坏死和氧化应激。2.线粒体可能是镉诱导细胞凋亡的重要靶点,线粒体的氧化损伤在镉诱导细胞凋亡、坏死中起着关键作用;3.硒可有效抑制镉诱导的脏器损伤、细胞氧化损伤,但具有一定的剂量范围和剂量选择性,即0.1mg Se/kg以下剂量实验动物模型安全、有效;4.0.2mg Se/kg单纯硒灌胃干预对大鼠是安全的,但用此剂量进行干预存在肝脏、睾丸细胞损伤加重的风险;5.抗氧化应激的关键分子Nrf-2参与硒抑制镉诱导的大鼠肝脏、睾丸损伤。