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目的:探讨超顺磁性氧化铁Feridex对神经干细胞活力、分化能力及凋亡等生物学特性有无影响。
方法:(1)从12.5天孕龄的小鼠胎鼠脑中分离、培养神经干细胞,并用无血清培养技术进行培养;用免疫荧光和免疫细胞化学染色方法对神经干细胞进行鉴定;(2)用Feridex与多聚赖氨酸(PLL)的复合物(FE—PLL)标记神经干细胞,采用普鲁士蓝染色法检测FE—PLL对神经干细胞的标记效率;(3)观察FE—PLL标记的神经干细胞克隆形成的速度,并分别于培养第1、3、5、7、9、11、13、15天用台盼蓝染色法检测细胞的活力,与未标记组进行比较;(4)将两组神经干细胞(A组:FE-PLL标记组;B组:未标记组)接种于用1%多聚赖氨酸包被的盖玻片上,用含10%胎牛血清和RA(0.5μg/ml)的培养基(未添加bFGF和EGF生长因子)诱导细胞分化,在倒置显微镜下观察两组细胞的分化情况,并通过免疫细胞化学技术用NSE抗体和GFAP抗体鉴定分化的细胞;(5)选取FE—PLL标记后培养1、3、7、15天的神经干细胞,采用AnnexinV—PI双染分析法及流式细胞术检测FE—PLL标记对神经干细胞凋亡的影响,同时选取相同时间点的未标记细胞作实验对照组,并用统计分析软件对数据进行统计分析。
结果:1.培养的细胞呈悬浮生长,可形成大小不等的细胞球,对细胞行免疫荧光染色呈现Nestin阳性;对分化后的细胞行免疫细胞化学染色可见NSE阳性细胞和GFAP阳性细胞。2.Feridex对神经干细胞生物学特性的影响:(1)用FE—PLL标记神经干细胞标记效率达98%;(2)FE—PLL标记的神经干细胞体外培养7-10天后,可形成含有数十至数百个细胞的小球,神经球颜色浅黄到深黄,与未标记组比较,其克隆形成的速度并没有减慢;对FE—PLL标记后培养第1、3、5、7、9、11、13、15天的NSCs用台盼蓝拒染法检测细胞的活力,统计结果显示:相同时间点的标记组与未标记组细胞活力无统计学差异(P>0.05);(3)用常规ABC法对标记组和未标记组细胞行抗NSE和抗GFAP免疫细胞化学染色,反应呈阳性,两组细胞在开始分化时间与分化程度上无明显差异;(4)采用流式细胞术对FE-PLL标记后培养1、3、7、15天的细胞和相同时间点未标记细胞进行凋亡检测,结果显示相同时间点标记组与未标记组细胞凋亡率无统计学差异(P>0.05)。
结论:1.本实验无血清培养技术培养的细胞能表达Nestin,并且能够自我增殖和分化为神经元和星形胶质细胞,具有自我更新和多向分化的能力,可以确定为神经干细胞,可用于其它有关神经干细胞的实验研究。2.Feridex与多聚赖氨酸的复合物FE—PLL在体外能够高效标记神经干细胞。3.Feridex标记后神经干细胞的活力、分化能力以及凋亡等生物学特性与未标记的神经干细胞比较未见明显差异。4.Feridex标记后的神经干细胞仍具有扩增和分化为神经元及星形胶质细胞的潜能。5.Feridex体外标记的神经干细胞为其在体研究提供了基础。6.用Feridex标记供体神经干细胞,为MRI无创性地在体动态监测移植神经干细胞的存活、迁移和分化情况提供了可能。